بعد الخلوي في مصير

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مجهر فلوري لتتبع الكبريتات في بكتيريا e coli في الوقت الفعلي بعد الإصابة بـ phage lambda. ابدأ بإنشاء محلل خشن من phage lambda، ثم قم بتنقية الفاج وإصابة e coli بواسطة phage lambda في أنبوب.

استمر في تتبع مصير الخلايا البكتيرية تحت المجهر. في نهاية المطاف، يمكن للنتائج أن تظهر في الوقت الفعلي مصائر خلوية مختلفة في e coli من خلال التعبير عن بروتينات فلورية مختلفة مرتبطة بنمو الخلية أو موتها. وبشكل عام، تتمثل إحدى خطوات التحقق من هذه الطريقة في إنشاء مخزون مُنقى وموسوم من FI.

لتجنب تكوين أجسام اشتمالية (fige sharing) أثناء التحضير والتنقية، قم أيضاً بتحسين معاملات التصوير تحت المجهر للسماح بنمو خلوي صحي. قم بتلقيح مزرعة ليلة واحدة من E 3 92 Lambda LZ one PPL star D في وسط LBM بكثافة خلوية تبلغ OD 600 حوالي 0.6، ثم حفز lygen في حمام مائي هزاز عند درجة حرارة 42 °C.

استمر في التحضين عند 37 °C حتى يظهر التحلل. ستصبح المزرعة صافية. أضف الآن 2% chloroform، ثم قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، انقل مستخلص العاثيات إلى زجاجات سعة 250 milliliter وقم بطرد مركزي للمزرعة. ثم استخلص السائل العلوي الذي يحتوي على جسيمات العاثيات وأجرِ عملية طرد مركزي ثانية لإزالة الحطام المرئي باتباع بروتوكولات معايرة العاثيات القياسية. قم بقياس تركيز العاثيات، ثم قم بتنقية العاثيات عبر تدرج كلوريد السيزيوم وقس النشاط باستخدام DPI لتحضير شرائح aro.

نظف ست شرائح مجهرية باستخدام 70% ethanol. رتب خمس شرائح كما هو موضح وثبتها باستخدام شريط لاصق. الآن، صب محلول 1.5% aros في وسط زراعي فوق الشرائح المثبتة.

ضع الشريحة الأخيرة في الأعلى، مع تجنب تكون فقاعات الهواء بعناية. ضع ثقلاً في الأعلى واترك AROS لتبرد لمدة 30 دقيقة تقريباً. قم بإزالة الشرائح الأربع الموجودة على الجوانب وغلف كتلة الشرائح بغلاف بلاستيكي لاصق.

باستخدام مزرعة بكتيريا محولة نمت طوال الليل كلقاح، قم بتنمية مزرعة في وسط LBMM، ثم قم بترسيب ملليلتر واحد من البكتيريا وإعادة تعليقها. علّق الخلايا في 20 µL من وسط LBMM المبرد بالثلج باستخدام طرف ماصة واسع.

أضف 20 µL من العاثيات المنقاة. اخلط المزيج برفق وحضنه أولاً على الثلج لمدة 30 دقيقة للسماح بامتصاص العاثيات. ثم ضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 35 °C لمدة خمس دقائق.

لتحفيز حقن الحمض النووي للبلعوم، قم بفصل أي تجمعات خلوية عن طريق الخلط. خفف الخليط بنسبة 1 إلى 10 في LBMM. الآن، ضع لوح LBM agro.

أضف ميكروليتر واحد من خليط خلايا العاثلة على شريحة غطاء. وبمجرد امتصاصها، ضع شريحة غطاء أخرى بلطف في الأعلى. ابدأ بالتقاط مجموعة صور عبر قناة YFP للإطار الزمني الأولي.

التقط سلسلة من 15 صورة بفواصل تبلغ 200 nanometer على طول المحور Z. بالإضافة إلى ذلك، التقط صورة واحدة مركزة عبر قناتي التباين الطوري و m cherry. ثم قم بتصوير مقطع فيديو بنظام التصوير الزمني (time-lapse) لمصير الخلية بعد العدوى.

لتقليل التبييض والسمية الضوئية أثناء تصوير المقطع الزمني، استخدم صورة واحدة لوضع Z لكل قناة في كل نقطة زمنية، وصوّر العينة باستخدام تباين الطور وقنوات YFP وM cherry بفواصل زمنية تبلغ 10 دقائق لمدة أربع ساعات تقريبًا. ابدأ تحليل الصور بإجراء عد يدوي للعافات، وسجل أيضًا موقع العافة وطول الخلية. وفي الإطار الزمني الأولي، سجل مصائر الخلايا سواء كانت محللة أو مستكنة أو غير مصابة.

قم أيضاً بتوثيق وقت التحلل وأي معلومات أخرى مطلوبة عن طريق تشغيل فيلم التصوير الزمني، واستخرج المزيد من المعلومات الكمية مثل مستوى الفلورة بمرور الوقت في الخلايا الفردية باستخدام خوارزميات التعرف الآلي على الخلايا وتتبع السلالات. عادةً ما تكون لويحات العاثيات الموصومة فلورياً أصغر بكثير من لويحات النوع البري، وتتطابق إشارات YFP و DAPI للعاثية التي تم تنقيتها بنجاح في الموقع ذاته. تدمج هذه البيانات مجموعات الصور الخاصة بقنوات تباين الطور و YFP و M cherry، والصور المراكبة المقابلة لها من فيلم التصوير الزمني.

تظهر العاثيات الفردية بوضوح في الإطار الزمني الأولي. وهنا تظهر خليتان، كل منهما مصابة بعاثية واحدة، بينما تظهر خلية واحدة مصابة بثلاث عاثيات. وعادةً ما يُلاحظ وجود عدد من العاثيات على سطح الخلية، بينما تظل عاثيات أخرى غير ممتصة.

مع مرور الوقت، تصبح نتيجة العدوى قابلة للتمييز. فبعد 80 دقيقة، تكون الخليتان المصابتان بعاثيات مفردة قد دخلتا كل منهما المسار التحليلي. ومع الإنتاج داخل الخلوي لعاثيات جديدة، تكون الخلية المصابة بثلاث عاثيات قد دخلت المسار الاندماجي الذي يتميز بإنتاج m Cherry من المحفز المسبق.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مخزون من العاثيات المنقاة لإصابة بكتيريا e co بواسطة العاثية lambda، وإجراء تصوير لدورة الحياة تحت المجهر في الوقت الفعلي.