إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو إنشاء مكتبة إدخال الينقولات عالية الكثافة في الإشريكية القولونية أو الشيغيلا فليكسنيري باستخدام الاقتران البكتيري. تسمح هذه التقنية بإنشاء مئات الآلاف من الطفرات البكتيرية الفريدة عن طريق الإدخال الجيني العشوائي لينقولات Tn10. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نقل البلازما في إيواء الينقولات يتم عن طريق الاقتران البكتيري بدلا من الطرق الأخرى الأقل كفاءة ، مثل التثقيب الكهربائي.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم إدخال الينقولات Tn10 نفسها في الجينوم بتحيز أقل من الينقولات الأخرى. باستخدام تقنية معقمة ، أضف ملليلتر واحد من الثقافة الليلية لسلالة المتبرع في أنبوب eppendorf معقم. يجب تسمية الأنبوب على سبيل المثال بحرف D للمتبرع.

افعل الشيء نفسه بالنسبة للسلالة المتلقية التي تزيل ملليلتر واحد من الثقافة الليلية للسلالة المتلقية في أنبوب eppendorf معقم. مرة أخرى على سبيل المثال ، المسمى ب R ، للمستلم. جهاز طرد مركزي كلا الأنبوبين لمدة دقيقة واحدة عند 14 ، 000 مرة G في درجة حرارة الغرفة.

يمكن القيام بذلك في جهاز طرد مركزي على الطاولة. أثناء تشغيل جهاز الطرد المركزي ، قم بإعداد المرشحات للاقتران. استخدم ملقطا معقما لوضع مرشح النيتروسليلوز على صفيحة أجار LB تحمل علامة لا تحتوي على مضادات حيوية.

بدلا من ذلك ، بدلا من مرشح النيتروسليلوز ، يمكن استخدام ورق نشاف معقم. ضع كل مرشح على لوحة أجار LB منفصلة لتقليل التلوث. تأكد من وضع كل مرشح على لوحة أجار LB التي تم تصنيفها بشكل مناسب.

اصنع ثلاث أطباق ، كل منها يحتوي على مرشح. واحد لسلالة المتبرع ، وواحد للسلالة المتلقية ، وواحد للمكتبة. بمجرد انتهاء جهاز الطرد المركزي ، قم بإزالة الثقافات بين عشية وضحاها.

قم بإزالة جميع وسائط النمو التي تحتوي على المضادات الحيوية من أنبوب eppendorf وتخلص منها. احرص على عدم تعطيل أو إزعاج منصة الخلية البكتيرية ، ولكن حاول إزالة جميع وسائط النمو. تأكد من العمل بشكل معقم وتغيير الأطراف بين كل عينة.

إلى كل أنبوب eppendorf ، أضف 110 ميكرولتر من وسائط LB الطازجة بدون مضادات حيوية وماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق المزرعة. تأكد من العمل بشكل معقم. عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان عدم وجود كتل خلايا.

تتم هذه الخطوة لتركيز المزرعة البكتيرية وإزالة أي مضادات حيوية متبقية من المزرعة الليلية. باستخدام ماصة، ضع 50 ميكرولترا من مزرعة المتبرعين المركزة على الفلتر المسمى المتبرع. أضف ببطء 50 ميكرولترا إلى الفلتر بطريقة قطرة.

افعل الشيء نفسه مع السلالة المتلقية التي تضيف 50 ميكرولترا من الثقافة المعلقة ، وهي الثقافة المعلقة المركزة على مرشح المتلقي بطريقة قطرة. لكي يحدث الاقتران ، تتم إضافة كل من السلالة المتلقية وسلالة المتبرع إلى نفس ورق الترشيح بحيث يكونان على اتصال جسدي وثيق. للقيام بذلك ، أضف 50 ميكرولترا من كل من السلالة المانحة والسلالة المتلقية إلى نفس المرشح على المكتبة المسماة.

ضع ألواح الأجار هذه التي تحتوي على المرشحات عند 37 درجة لمدة ست ساعات. تحدث عملية الاقتران على مدى ست ساعات عند 37 درجة مئوية. أثناء الاقتران ، ينتقل البلازمين pJA1 إلى السلالة المتلقية.

بعد الاقتران ، يتم فصل البكتيريا عن المرشح عن طريق الدوامة ويتم إحداثها ب IPTG واحد مليمول. يحفز IPTG الترانسبوزاز ويتم إدخال الينقولات التي تحتوي على جين مقاومة الكاناميسين بشكل عشوائي في جينوم السلالة المتلقية. يتم طلاء البكتيريا على ألواح أجار LB تحتوي على الكاناميسين ومضاد حيوي آخر لاختيار السلالة المتلقية التي تحتوي على الينقولات.

السلالة المتلقية هي Lambda pir سالبة ، لذلك يتم فقد البلازمين pJA1. بعد ست ساعات من النمو عند 37 درجة مئوية ، يكتمل الاقتران. قم بإزالة الألواح التي تحتوي على المرشحات من الحاضنة.

استخدم ملقطا معقما لإزالة المرشح الذي يحتوي على عنصر تحكم سلبي للمتبرع من لوحة أجار LB. اضغط على الأنبوب لتوصيل ورق الترشيح إلى أسفل القارورة المخروطية وتأكد من غمر المرشح بالكامل في وسائط LB. يحتوي هذا الأنبوب على ملليلترين من وسائط LB مع IPTG وتركيز نهائي يبلغ ملليموليا واحدا.

قم بتدوير الأنبوب لمدة دقيقة واحدة لفصل البكتيريا عن مرشح النيتروسليلوز. يجب أن تصبح وسائط LB غائمة مع الخلايا البكتيرية. كرر هذا لعنصر تحكم المستلم والمكتبة أيضا.

تدوير المرشحات التي تحتوي على الخلايا البكتيرية تماما لفصل البكتيريا عن المرشح ، يتم طلاء الخلايا البكتيرية على وسائط محددة. في هذه الخطوة ، يتم طلاء البكتيريا في ألواح أجار LB التي تحتوي على الكاناميسين ومضاد حيوي آخر مثل حمض الناليديكسيك. يستخدم الكاناميسين لاختيار الخلايا المتلقية التي تحتوي على الينقولات التي تحتوي على علامة مقاومة الكاناميسين التي تم دمجها بنجاح في الجينوم.

يتم اختيار الخلايا المتلقية التي لم يتم دمج العلامة في الجينوم ضدها. يستخدم مضاد حيوي آخر مثل حمض الناليديكسيك للاختيار ضد سلالة المتبرع. السلالة المانحة المستخدمة هنا حساسة لحمض الناليديكسيك ، في حين أن السلالة المتلقية مقاومة لحمض الناليديكسيك.

باستخدام هذا المضاد الحيوي الثاني ، من الممكن إزالة سلالة المتبرع. في هذه الخطوة ، يجب طلاء العديد من التخفيفات لتحديد تخفيف المكتبة الذي ينتج عنه العديد من المستعمرات المتباعدة بشكل كاف. بعد حساب وتسجيل عدد المستعمرات على جميع اللوحات التي تحتوي على مكتبة الينقولات ، قد يرغب بعض المستخدمين في تجميع المكتبة أو دمجها في أنبوب واحد.

يمكن القيام بذلك باستخدام مفرشة معقمة. أضف ملليلتر واحد من وسائط LB إلى لوحة أجار LB التي تحتوي على مكتبة الينقولات. بمجرد إضافة الوسائط إلى اللوحة ، استخدم الموزعة المعقمة لكشط البكتيريا وفصلها عن اللوحة.

غالبا ما لا يكون من الممكن إخراج جميع البكتيريا من اللوحة. قم بإزالة المعلق البكتيري وضعه في شكل مخروطي 50 مل أو 15 مل. كرر هذا لجميع اللوحات.

بمجرد كشط جميع الألواح ، قم بتدوير التعليق البكتيري المجمع لمدة دقيقة كاملة لتفتيت أي كتل خلايا. هذا يشكل الآن المكتبة المجمعة. بعد النمو عند 37 درجة لمدة 18 ساعة ، يجب ألا يكون هناك نمو على لوحات التحكم المانحة أو المتلقية.

اللوحات التي تحتوي على مكتبة الطافرة بشكل مثالي على العديد من المستعمرات بأحجام متنوعة. أشارت أحجام المستعمرات المختلفة إلى استنساخ لياقة بدنية متفاوتة وهي علامة جيدة على نجاح البروتوكول. من المحتمل أن يكون إنشاء مكتبة طفرات الينقولات الكثيفة في البكتيريا مفيدا للعديد من التطبيقات النهائية ، بدءا من اكتشافات جينات الفوعة ومسببات الأمراض البكتيرية إلى دراسة الجينات الأساسية إلى تحديد شبكات التفاعل الجيني.

تعتمد كل هذه التطبيقات النهائية على بناء مكتبة إدخال الينقولات الكثيفة. توفر الطريقة المعروضة هنا إجراء بسيطا وسريعا وغير مكلف لإنشاء مكتبة ينقولات كثيفة للغاية في سلالات البكتيريا المعوية مثل الإشريكية القولونية أو الشيغيلا فليكسنيري.