الصلبة مرحلة تجميع Submonomer من البوليمرات Peptoid واحترامهن الجمعية ، في الارتحال التي تأمر Nanosheets

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف طريقة بسيطة وفعالة لتخليق الببتيدات في الطور الصلب والتجميع الذاتي المائي للببتيدات إلى صفائح نانوية عالية التنظيم. تشبه الببتيدات البوليببتيدات من الناحية التركيبية، وهي عبارة عن بوليمرات جلايسين مستبدلة حيث ترتبط السلاسل الجانبية بالنيتروجين بدلاً من كربون ألفا. تبدأ العملية بتخليق تسلسل ببتيدي محدد عبر طريقة المونومر الفرعي الأخرى.

تتكون طريقة المونومر الفرعي من خطوتين كيميائيتين بسيطتين تدرجان كل مونومر في السلسلة بالتتابع. أولاً، تتم برومة أسيتيل لمجموعة أمين مرتبطة بدعامة صلبة. ثانياً، يتم استبدال البروميد بأمين أولي.

تُكرر هذه الخطوات حتى يتم الوصول إلى طول السلسلة المطلوب. بعد استطالة السلسلة، يتم فصل الببتيد عن الدعامة الصلبة، ثم يُنقى زيت الببتيد الخام الناتج بواسطة HPLC ويُوصّف لبدء التجميع الذاتي للببتيدات إلى صفائح نانوية. يتم تحضير محلول منظم مائي مخفف من الببتيد في قنينة زجاجية ويُخلط بلطف. كخطوة نهائية.

يتم فحص الصفائح النانوية تحت المجهر. وتظهر النتائج أن دورة تكرارية من خطوتين كيميائيتين بسيطتين يمكن أن تنتج بوليمراً محدد التسلسل يتجمع ذاتياً بشكل تلقائي إلى صفائح نانوية. وتعد الببتيدات فئة جديدة من البوليمرات المستوحاة حيوياً والتي تمتلك خصائص تقع بين خصائص البروتينات والبوليمرات التقليدية.

تتميز الببتيدات بكونها متينة ومتعددة الاستخدامات تخليقياً مثل البوليمرات التقليدية، ولكنها أيضاً قابلة للضبط الدقيق ومحددة التسلسل مثل البروتينات والحمض النووي DNA، وهي تبرز حالياً كمواد متطورة لمعالجة مشكلات رئيسية في الطب الحيوي وعلم المواد، مثل تحديد العقاقير ذات النشاط الحيوي أو تصميم البروتينات الاصطناعية. وتشمل المزايا الرئيسية للببتيدات التحكم الدقيق في التسلسل، وتوفر وحدات بناء متنوعة للغاية، وكفاءة التخليق، والاستقرار تجاه إنزيمات البروتياز. ويتم هنا عرض طريقة التخليق اليدوي العام للببتيدات، والتي تتضمن معدات أساسية وكواشف متاحة تجارياً، مما يتيح تخليق الببتيدات بسهولة في معظم المختبرات.

يعد العرض المرئي للخطوات الاصطناعية أمراً بالغ الأهمية ويشكل مرجعاً قيماً للأفراد الذين يدخلون مجال الاصطناع على الطور الصلب. ولأول مرة هنا، يتم وصف تنقية وتوصيف ببتيد أمفيفيلي مكون من 36 مير (36 mers) بالإضافة إلى تجميعه الذاتي في صفائح نانوية عالية التنظيم. ابدأ هذا البروتوكول بتجهيز الجهاز التجريبي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

سيتم تنفيذ الخطوات التالية في وعاء تفاعل زجاجي بدلاً من خرطوشة مسامية من البولي بروبيلين المخصصة للاستخدام مرة واحدة وذلك من أجل الوضوح. بعد وضع 100 milligrams من راتنج R amide في وعاء تفاعل مسامي، يتم ترطيب الراتنج بإضافة two milliliters من dimethyl form amide أو DMF مع التقليب عن طريق الفقاعات لمدة 10 minutes. ثم يتم تصريف المحلول باستخدام المفرغة لعزل الراتنج المرطب.

بعد ذلك، أضف 1 مل من 20% full methyl pyridine في DMF لإزالة حماية مجموعة FM O. قم بالرج لمدة دقيقتين ثم قم بتصريف السائل. كرر هذه العملية لمدة 12 دقيقة، ثم اشطف الراتنج بإضافة 2 مل من DMF مع الرج لمدة 15 ثانية والتصريف.

ابدأ تنمية سلسلة الببتيد بدورة المونومر الفرعية الأولى، والتي تتضمن خطوة أسيتلة بالبروم وخطوة إزاحة. ولإجراء الأسيتلة بالبروم، أضف 1 mL من حمض البرومو أسيتيك بتركيز 0.6 M في DMF و 86 µL من di isopropyl carbo mite. وبعد الرج لمدة 30 دقيقة، قم بتصريف السائل والشطف باستخدام 2 mL من DMF.

بعد ذلك، قم بإجراء عملية الإزاحة عن طريق إضافة 1 mL من أمين بتركيز 1 إلى 2 M في N-methyl pyrrolidone، ثم يتم التحضين لمدة تتراوح من 30 إلى 120 دقيقة؛ وبعد انتهاء التحضين، يتم التصريف والشطف باستخدام 2 mL من DMF. مرة أخرى، استمر في نمو سلسلة الببتيد عن طريق تكرار دورة المونومر الفرعية. وبعد إتمام عملية الإزاحة النهائية، يتم الشطف باستخدام 2 mL من DMF.

اتبع ذلك بوضع غطاء غسيل الميثان diora، ثم قم بتخزين وعاء التفاعل حتى مرحلة الفصل. لبدء عملية الفصل، انقل جميع الراتنج المجفف إلى قارورة زجاجية للوميض سعتها 20 milliliter أثناء العمل داخل غطاء سحب وباستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، ثم أضف أربعة milliliter من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك، أو خليط فصل TFA، إلى القارورة الزجاجية للوميض وأغلقها بالغطاء. قم بالتقليب بإحكام لمدة تتراوح من 10 دقائق إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

بدلاً من ذلك، استخدم هزازاً دواراً لخلط المحلول. اجمع محلول شطر TFA عن طريق ترشيح الراتنج من خلال خرطوشة مسامية من البولي بروبيلين قابلة للتخلص منها في قارورة زجاجية للوميض سعة 20 milliliter جديدة وموزونة مسبقاً. بعد ذلك، أضف واحد milliliter من كوكتيل الشطر الطازج لشطف الراتنج وجمع أي ببتيد متبقٍ.

كرر هذه العملية، ثم اشطف مرتين. قم بتبخير TFA عن طريق نفخ تيار خفيف من النيتروجين أو باستخدام جهاز biot charge. V 10 evaporator red، أذب الزيت الخام في ستة ملليلترات من خليط بنسبة واحد إلى واحد من الأسيتونيتريل والماء.

بعد ذلك، يتم تجميد العينة وتجفيفها بالتجميد. يجب تكرار هذه العملية مرة أخرى بعد عملية التجفيف بالتجميد الثانية. يتم تسجيل وزن المنتج الخام وتخزينه في صورة مسحوق جاف عند درجة حرارة -20 °C، مع التحقق منه باستخدام مزيج من HPLC التحليلي و/أو LCMS بالترذيذ الإلكتروني.

يمكن تحديد نقاوة المنتج الخام وما إذا كان الوزن الجزيئي المطلوب متوفراً من خلال اتباع الإجراءات الموضحة في النص. بعد ذلك، يمكن تنقية خليط الببتيد الخام باستخدام تقنية HPLC التحضيرية ذات الطور المعكوس وفقاً للإجراء المكتوب. يصف هذا القسم البروتوكول الخاص بتكوين صفائح من ببتيد amphiphilic مكون من 36 حمضاً أمينياً، وهو عبارة عن تسلسل سلسلة واحدة محدد.

بعد تخليق سلسلة الببتيد وتنقيته وتجفيفه بالتجميد، يُذاب المسحوق الأبيض الناتج في DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 2 millimolar. بعد ذلك، يتم استخدام ملف Dr.Glass واحد لتحضير محلول ببتيد بتركيز 20 micromolar. أولاً، أضف 445 microliters من مياه milli Q و 50 microliters من منظم تكوين الصفائح بتركيز 10 x.

قم برج القارورة باستخدام جهاز الرج (Vortex) للمزج. ثم أضف 5 µL من محلول peptide مخزن بتركيز 2 mM وقم بالانتفاخ برفق. تتكون رقائق المحلول الناتجة عن طريق التحريك اللطيف لمحلول peptide المائي المخفف.

قم بإمالة القارورة الزجاجية المسدودة ببطء من الوضع الأفقي إلى الوضع الرأسي. تؤدي هذه العملية إلى تكوين رقائق من خلال الرج اللطيف، كما تنتج رقائق أيضاً. ومع ذلك، تميل الرقائق الناتجة إلى أن تكون أصغر حجماً وبعدد أقل من الحواف المستقيمة مقارنة بالعديد من الرقائق عالية الجودة.

قم بتدوير القوارير الزجاجية حول المحور الأفقي ببطء لمدة يوم واحد باستخدام جهاز تدوير الأنابيب أو هزاز مخصص للتصبيغ الفلوري للصفائح النانوية، ثم أضف 1 µL من Nile red بتركيز 100 µM إلى 100 µL من محلول الصفائح النانوية للحصول على تركيز نهائي قدره 1 µM من Nile red. يُعد Nile red صبغة حساسة للبيئة تزداد شدة فلوريتها عندما تتمركز في البيئات الكارهة للماء. بعد ذلك، قم بتحضير محلول aros بتركيز 1% في ماء ساخن واسكبه في طبق بتري بلاستيكي.

تأكد من أن محلول الأجروز يبلغ سمكه حوالي ثمن بوصة، واترك المحلول ليبرد دون تحريك على سطح مستوٍ. وبعد أن يتماسك الأجروز، استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لقص مربعات بحجم سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد. ثم انقل المربعات المقصوصة إلى شريحة زجاجية لتجميع الرقائق في نفس المستوى، وضع ميكرولتر واحد من محلول الرقائق على قطعة الأجروز.

بعد مرور دقيقتين، يجب أن يمتص الـ aros المحلول المنظم مما يترك الصفائح على السطح. قم بتصوير الصفيحة خلال 15 دقيقة. بدلاً من ذلك، لتصوير الصفائح والمحلول، قم بتحميل 15 µL داخل حشية بقطر 20 mm وسمك 0.12 mm على شريحة زجاجية.

قم بتغطية العينة بغطاء شريحة (cover slip) والتصوير خلال بضعة أيام لإجراء الفحص بالمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لرقائق النانو. أولاً، قم بإجراء نقش بالبلازما لرقائق السيليكون للمساعدة في امتصاص رقائق النانو. بعد ذلك، ضع 20 µL من محلول رقائق الببتيد على ركيزة سيليكون معالجة بالبلازما واترك المحلول لمدة ثلاث دقائق، ثم أزل المحلول الزائد باستخدام طرف منديل Kim wipe، ثم ضع 20 µL من الماء على السطح وقم بامتصاص المحلول الزائد مرة أخرى لإزالة المنظم والأملاح.

وبدلاً من ذلك، يتم إجراء ديالة لمحاليل رقائق الببتيد مقابل الماء لإزالة المنظم والملح. وفي هذه الحالة، يمكن وضع 20 microliters من محلول الرقائق الذي خضع للديالة على ركائز السيليكون المعالجة بالبلازما وتركها لتجف في الهواء. وبعد جفاف محلول الرقائق على ركائز السيليكون المعالجة بالبلازما، يمكن تصوير الرقاقة باستخدام SEM باستخدام كاشف داخل العدسة عند طاقات شعاع تتراوح بين one kilovolt و five kilovolts.

تم إجراء تخليق وتوصيف وتنقية لببتيد شحنة كتلية 36 me محدد التسلسل، والذي ينطوي ليشكل ورقة نانوية ثنائية الأبعاد عالية التنظيم. تم استخدام الأمينات في تخليق ببتيد شحنة كتلية 36 me من إيثيلين ديامين إلى فينيل إيثيل أمين و t butyl beta alanine. بعد التخليق، تم فصل الببتيد الخام من الراتنج باستخدام TFA مائي بتركيز 95%.

بعد جمع محلول TFA وتبخيره، تم تنقية ببتيد الشحنة الكتلية الخام 36 me باستخدام تقنية HPLC ذات الطور المعكوس. ثم تم تأكيد كتلة ببتيد الشحنة الكتلية المنقى بواسطة moldy.

تتطابق الكتلة المرصودة 4981.2 بشكل وثيق مع الكتلة المحسوبة البالغة 4981.74. تم إذابة المسحوق المجفف بالتجميد في DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 2 millimolar وحُفظ عند درجة حرارة 4 °C. تم تحضير الشرائح وفقاً للبروتوكول المذكور أعلاه وتصويرها باستخدام المجهر الضوئي الفلوري.

لوحظت مجموعة متنوعة من الأشكال التي تتراوح أحجام ميزاتها حتى 300 ميكرون، وبرزت بشكل ملحوظ الحواف المستقيمة. استُخدم المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) أيضاً لتصوير الصفائح، وهو ما كشف وبالمثل عن حواف مستقيمة بارزة. يصف هذا الفيديو بروتوكولاً مباشراً وفعالاً للتخليق السطحي الصلب للببتيدات والتجميع الذاتي المائي للببتيدات في شكل صفائح نانوية.

بما أن مئات اللبنات الأساسية من الأحماض الأمينية متاحة بسهولة ويمكن استخدامها في هذا البروتوكول، فإن نطاق التصميم المتاح باستخدام البولي ببتيدات غير محدود عملياً. وتعد الببتيدات مواد واعدة لأبحاث الطب الحيوي وعلوم النانو نظراً لمرونتها الاصطناعية، ومتانتها، وقدرتها على التنظيم. وعلى المستوى الذري بشكل خاص، تعمل الصفائح النانوية كمنصة محتملة لسقالات العرض ثنائية الأبعاد، ومحاكاة الأغشية، والمستشعرات البيولوجية، ومحاكاة البروتينات، وتصنيع الأجهزة.

إن العمل مع الكواشف المسببة للتآكل مثل trior، وحمض الأسيتيك، وحمض البرومو أسيتيك ينطوي على خطورة بالغة؛ لذا وللوقاية من الإصابات، يجب إجراء جميع التفاعلات داخل خزانة استخلاص الغازات وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.