طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليل تدهور الصور البيولوجية الناتج عن المسافات الهوائية في أوراق النباتات للحصول على صور أكثر وضوحاً للخلايا الحية داخل الورقة. إذا تم تثبيت الورقة في وسط تثبيت مائي وتم تحفيز الفلوروفور بواسطة الليزر، فإن العديد من المساحات الهوائية غير المملوءة والتغيرات في معامل الانكسار داخل النسيج الموضح باللون البرتقالي تحد من قوة الإشارة القادمة من عمق النسيج في الصورة الناتجة. أما إذا تم تثبيت الورقة بدلاً من ذلك في مادة per fluoro deline أو PFD، فإن تحفيز الليزر الناتج للفلوروفور يكون أقل تخامداً ويسمح بنقل أفضل للإشارات المنبعثة.

وفي الختام، فإن استخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر مع وسط التركيب PFD يعطي صوراً واضحة للخلايا الحية داخل ورقة النبات على عمق يزيد عن ضعف العمق الممكن تحقيقه عند استخدام وسط تركيب مائي. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تثبيت الأوراق أو تركيبها في أوساط مائية، في أنها تقلل الانكسار داخل النسيج المتوسط (mesophyll)، مما يسمح بتصوير أكثر دقة للخلايا الحية في أعماق أكبر داخل الورقة، وهو ما كان يشكل تحدياً سابقاً. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة محورية في علم النبات، مثل دراسة بيولوجيا خلايا النسيج المتوسط والإشارات الحيوية داخل الكائن الحي (in vivo)، واستعمار المسببات المرضية للأوراق والتفاعلات بين المسببات المرضية والنسيج المتوسط، كما يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى معمقة حول بيولوجيا النبات الأساسية.

ويمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة الأخرى ذات معامل الانكسار العالي والغنية بالمساحات الهوائية، مثل اللوالب الداخلية أو رئات الفقاريات. وسيقوم الدكتور George Littlejohn من مختبري في Mount Leaf باستعراض هذا الإجراء. تبدأ العينات في PFD بتحضير شريحة مجهرية باستخدام حاشية نفاذة للغاز من مادة poly dimethyl siloxane أو P-D-M-S، وهي عبارة عن بوليمر لزج مرن يمكن تشكيله لتوفير غرفة مصممة خصيصاً وفقاً للمتطلبات التجريبية.

قم بموازنة الـ PFD مع الهواء عن طريق رج حجم صغير من الـ PFD في زجاجة مملوءة بالهواء. ويمكن تحقيق ذلك أيضًا عن طريق تمرير فقاعات من الهواء عبر الـ PFD؛ بعد ذلك، صب الـ PFD في أطباق بتري مفتوحة وقم بتعويم شتلة كاملة أو ورقة مقطوعة على السائل لمدة خمس دقائق. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة بشكل يشبه الأنسجة المزجججة.

قد تبدو الأوراق بلون أغمق أو أفتح مما كانت عليه قبل التعرض لـ PFD، وذلك بناءً على ظروف الإضاءة وعمر النسيج المستخدم. وأخيرًا، املأ حجرة PDMS بـ PFD المهوى، وانقل عينات النسيج بعناية من طبق بتري الخاص بالتحضين إلى حجرة PDMS. أحكم غلق الشريحة باستخدام غطاء الشريحة ثم قم بالتصوير.

وفقاً للمتطلبات التجريبية، تم تحضين أوراق الأشهر لمدة خمس دقائق في معلق من البروتين الفلوري الأخضر المؤتلف أو GFP. وفي الفحص المجهري بـ PFD، تظهر عينات الأوراق المحضنة بـ PFD أن غالبية الفراغات الهوائية غمرت بالـ GFP المؤتلف المعلق في PFD. يظهر GFP باللون الأخضر، بينما يمثل اللون الأحمر الكلوروفيل، والفلورة التلقائية، وخلايا الميزوفيل.

من الواضح أن الورقة تُغمر عند الحضانة باستخدام PFD، ولكن قد تظل هناك جيوب هوائية متفرقة. ولا يغمر الماء الورقة في ظل هذه الظروف. هنا، تم تحضين وتركيب أوراق opsys تعبر عن Venus، وهو بديل لـ YFP يتمركز في العصارة الخلوية، في الهواء أو الماء أو PFD باستخدام المسح الليزري. ويظهر المجهر البؤري للعينات تفوق PFD على الهواء والماء، مع زيادة تقريبية بمقدار ضعفين في عمق التصوير.

عند مقارنة PFD بالماء، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى 10 دقائق بمجرد إتقانها إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء إجراء هذه العملية، من المهم تذكر أن perflurodecalin يذيب طلاء الأظافر والتفلون، ولكنه متوافق مع شحم السيليكون. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام perflurodecalin كوسيط تثبيت لتحسين التصوير في خلايا أوراق النباتات.

لا تنسَ أنه على الرغم من أن مادة per fluoro delin غير سامة، إلا أننا نوصي باتباع ممارسات السلامة القياسية عند تنفيذ هذا الإجراء.