تحليل خلية معينة من

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعة من البروتوبلاستات النوعية لأنواع خلوية محددة من الورقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال زراعة نباتات تعبر عن GFP في أنواع خلوية محددة في الورقة. وتتمثل الخطوة الثانية في حصاد الأوراق وتوليد البروتوبلاستات باستخدام الهضم الإنزيمي.

بعد ذلك، يتم ترشيح البروتوبلاستات وفرزها باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). وتتمثل الخطوة النهائية في تأكيد دقة الفرز باستخدام المجهر الفلوري. وفي النهاية، يمكن استخدام البروتوبلاستات المفرزة لتحليل التعبير الجيني النوعي لكل نوع من الخلايا، أو التحليل البروتومي، أو التوصيف الأيضي.

لقد استُخدم فرز الخلايا المنشط فلورياً بنجاح سابقاً في الجذور، ولكن يتم استخدامه هنا لعزل خلايا الأوراق. لقد كان الوسم بـ GFP قبل تطبيق هذه الطريقة محدوداً بسبب التداخل الناتج عن فلورة الكلوروفيل. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث أن التحضير السريع والدقيق للعينة ضروري لتقليل التغيرات الفسيولوجية الواسعة التي يمكن أن تحدث أثناء عملية فرز الخلايا.

بشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنهم لن يكونوا على دراية بكيفية إعداد جهاز فرز الخلايا أو كيفية التأكد من دقة عملية الفرز. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الأنظمة النباتية. وتكمن المشكلة في تحديد شبكات تنظيم الجينات في أعضاء متعددة الخلايا ومعقدة مثل الورقة، في أن أنواع الخلايا المختلفة تعبر عن مجموعات مختلفة من الجينات.

تُفقد هذه المعلومات الجينية في تحليل الحصاد لورقة كاملة توضح الإجراء. سيكون برفقتي إليسون أس وسانجيف كومار، اللذان يقدمان الدعم الفني لهذا العمل في مختبرنا. أولاً، املأ طبق بتري دائرياً بقطر 9 cm بـ 20 mL من المحلول A الذي يحتوي على إنزيمات الترسيب الأولي ومثبطات النسخ وRNAs.

بعد ذلك، قم بجمع مادة الأوراق المطلوبة للعينات التي تحتوي على أكثر من ورقة واحدة، مثل العينة الموضحة هنا. رتّب الأوراق في كومة تصل إلى 15 ورقة. ثم استخدم شفرة حلاقة لتقطيع الأوراق إلى شرائح بعرض 1 mm.

انقل شرائح الأوراق فوراً إلى أطباق بتري باستخدام ملقط مسطح، وافصل الشرائح برفق، ثم قم بإجراء الارتشاح بالتفريغ (vacuum infiltrate) للعينات مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة. بعد ذلك، ضع طبق بتري على هزاز مداري مضبوط على 90 RPM في درجة حرارة الغرفة واترك عينات البروتوبلاست لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات. وخلال فترة التحضين، استخدم الملقط لفصل شرائح الأوراق عن بعضها البعض على فترات زمنية كل نصف ساعة.

بعد عملية الهضم، قم بترشيح محلول البروتوبلاستات برفق عبر مصفاة خلايا بقطر 70 micron في أنبوب سعة 50 milliliter. ستعمل المصفاة على احتجاز شرائح الأوراق لإزالتها، بينما تمر البروتوبلاستات من خلالها.

استخدم الآن 4 mL من المحلول A لشطف شرائط الأوراق برفق، مع تجميع سائل الغسيل في أنبوب سعة 50 mL. بعد ذلك، انقل معلق البروتوبلاستات إلى أنابيب ذات قاع مستدير، وقم بطرد البروتوبلاستات مركزياً لمدة خمس دقائق عند 300 ×g وفي درجة حرارة الغرفة. مع الحرص على عدم تعكير الراسب، اسحب أكبر قدر ممكن من السائل الطافي برفق، ثم اغسل البروتوبلاستات باستخدام 5 mL من المحلول A تحت نفس ظروف الطرد المركزي.

أخيراً، بعد إزالة الطافي العلوي، استخدم طرف ماصة P 1000 مقطوعاً لإعادة تعليق الـ PROTOPLASTS في حجم مناسب من المحلول A قبل عملية الفرز مباشرة. استخدم طرف ماصة P 1000 غير مقطوع لتفكيك أي تكتلات في محلول الـ Protoplasts. ثم قم بفصل الخلايا بشكل أكبر عن طريق ترشيح الـ protoplasts في أنبوب الفرز باستخدام مرشح fillon بمسامية 50 micron.

ثم قم بتخفيف محلول الخلايا حسبما يلزم لتجنب انسداد فوهة سحب الخلايا. بعد تحديد الظروف المثلى لسحب الخلايا، قم بتحديد البروتوبلاست الموجبة لـ GFP باستخدام ليزر Argonne بطول موجي 488 نانومتر مع مقارنة المخرجات من مرشح تمرير النطاق 580 30 مقابل مرشح تمرير النطاق 530 40. لاحظ أن البروتوبلاست الموجبة لـ GFP ستظهر في المجموعة ذات القيمة العالية لـ 530 والقيمة المنخفضة لـ 580.

مع وجود البروتوبلاست غير الفلورية (غير GFP) في مجموعة الـ 530 المنخفضة والـ 580 المنخفضة، تظهر البروتوبلاست الميتة والمحتضرة والحطام في مجموعة الـ 580 المرتفعة؛ ولغرض تصور البروتوبلاست المفروزة باستخدام المجهر الفلوري، يتم فرز البروتوبلاست مباشرة في ثمانية أحجام على الأقل من المحلول A، ثم تُركز البروتوبلاست بعد الفرز عن طريق الطرد المركزي. يمكن فرز البروتوبلاست في ثمانية أحجام من المحلول A وجمعها للتصور عبر المجهر الفلوري للتحقق من الإثراء. تُظهر هذه الصورة الأولى مثالاً لإثراء الخط الخلوي TP 382، الذي يعبر عن GFP في الخلايا الحارسة. وتلخص هذه الجداول أمثلة على العوائد التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة قبل التضخيم وبعده.

تعتبر الكميات التي تتراوح بين 500 picograms و50 nanograms كافية للتضخيم باستخدام نظام ovation PICO WTA والتحليل اللاحق بواسطة quantitative PCR أو next generation sequencing أو microarray. وتظهر هذه السلسلة التالية من الصور خطوط خلايا بروتوبلاست متنوعة تم عزلها وفرزها وفقاً للطريقة الموصوفة للتو. وقد اشتُقّت هذه البروتوبلاست الأولى من أوراق KC 2 74، وهو مقطع عرضي لـ KC 2 74.

تظهر الورقة أن بروتين GFP يتم التعبير عنه في الأنسجة الوعائية. وقد تم عزل هذه البروتوبلاست من أوراق KC 4 64، ويظهر المقطع العرضي لورقة KC 4 64 أن التعبير عن GFP يوجد في بشرة A dal. وأخيراً، تم اشتقاق هذه البروتوبلاست من أوراق TP 3 82 في أوراق TP 3 82.

يتم التعبير عن بروتين GFP في الخلايا الحارسة هنا. تظهر مخططات النقاط النموذجية للاستحواذ على البيانات والتي توضح المخرجات من مرشحات تمرير النطاق 5 80 30 نانومتر مقابل مرشحات 5 30 40 نانومتر. وبوابة الفرز الموضحة هي تلك المستخدمة عادةً أثناء عملية الفرز.

يوضح مخطط النقط هذه في البداية للبروتوبلاست المستمدة من أوراق نبات col4 والتي تم تحضيرها في غياب المثبطات وجود مجموعة واحدة ذات فلورة منخفضة عند 530 ومنخفضة عند 580. بينما يظهر مخطط النقط هذا للبروتوبلاست المستمدة من أوراق نبات col4 من النوع البري والتي تم تحضيرها في وجود المثبطات الإزاحة في فلورة 580 التي تحدث نتيجة للإجهاد والتلوين الناجم عن المثبطات. وتعود مخططات النقط هذه إلى بروتوبلاست مستمدة من أوراق السلالات KC 74 و KC 4 64 و TP 3 82 على التوالي.

كما تم تحليل هذه العينات في وجود مثبطات، مما أظهر أن GFP يتركز في المجموعات ذات القيمة العالية 530 والقيمة المنخفضة 580. وفي هذه التجربة الممثلة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، تم الحصول أولاً على عينات لكل نوع من أنواع الأجزاء. ثم تم تضخيم العينات باستخدام نظام ovation PICO WTA وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

تم استخدام بادئات متخصصة لـ GFP. القيم الموضحة هي أعلى القيم باللون الأحمر وأدناها باللون الأخضر، وتتم الإشارة إلى متوسط القيم أو القيم الفردية باستخدام actin two كجين مرجعي بواسطة الأشرطة الصفراء الأفقية. تمثل النتائج إعادة تحقق من التقييمات الضوئية لمحتوى GFP في الأجزاء المفروزة.

أظهرت المجموعة ذات الـ 530 العالية والـ 580 المنخفضة أعلى مستويات قابلة للقياس من تعبير GFP. وبينما أظهرت المجموعة ذات الـ 530 العالية والـ 580 العالية تعبير GFP أقل بنحو 1000 ضعف، أظهرت المجموعات ذات الـ 530 المنخفضة والـ 580 المنخفضة، والـ 530 المنخفضة والـ 580 العالية، مستويات منخفضة من تعبير GFP كانت قابلة للمقارنة مع مستويات مجموعة الضابطة من الورقة الكاملة ومجموعات البروتوبلاست غير المفروزة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع إلى خمس ساعات من النبات وصولاً إلى مجموعة الخلايا المفروزة إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة جهاز فرز الخلايا باستمرار وإعادة معايرته إذا لزم الأمر من أجل الحفاظ على دقة الفرز.

تم العثور على هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل المصفوفات الدقيقة (microray analysis) من أجل مقارنة ومقابلة مستويات التعبير الجيني في أنواع مختلفة من الخلايا. والآن، بعد تطوير هذه التقنية، نقوم بتحليل التعبير الجيني في أنواع محددة من خلايا الأوراق في مراحل نمو مختلفة، وسنقوم بمقارنة ذلك بالبيانات المستمدة من الورقة كاملة والتي تم إنتاجها في مشروع العلوم الزراعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل أنواع الخلايا المفردة من الأوراق باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة.