صياغة النانوية Diblock البوليمر من خلال تقنيات Nanoprecipitation

الهدف العام من هذا الإجراء هو تخليق جسيمات نانوية بوليمرية باستخدام طريقة الترسيب النانوي. ويتم تحقيق ذلك من خلال إجراء تفاعل E-D-C-N-H-S أولاً لتوليد بوليمر مشترك من A-P-L-G-A PEG. ثم يُستخدم البوليمر المشترك PLGA PEG لإنتاج الجسيمات النانوية، مع تغليف الدواء أو المادة المراد تحميلها من خلال الترسيب النانوي.

في هذه المرحلة، يمكن إجراء التوصيف الفيزيائي الحيوي الأساسي، بما في ذلك الحجم، والشحنة السطحية، وكفاءة تحميل الدواء، وذلك من خلال تشتت الضوء الديناميكي، أو المجهر الإلكتروني النافذ، أو تقنية HPLC. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج الأورام لأن الجسيمات النانوية يمكنها إيصال العلاجات المضادة للسرطان ضعيفة الذوبان، والتي قد تكون أكثر فعالية من العلاجات الحالية. وعلى الرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول علاج السرطان.

ويمكن استخدامه أيضاً لدراسة أنظمة أخرى مثل النقل الخلوي. كما يمكن ربط الجسيمات النانوية بربيطة استهداف وتصورها داخل الجسم الحي (in vivo) أو خارج الجسم (in vitro) من خلال استخدام عامل تصوير يوضح هذه التقنية. سيكون معنا اليوم فنيان من مختبرنا، وهما Rohit Sukumar وNatalie Cummings. لبدء تخليق البوليمر المشترك PLGA PEG، قم بإذابة PLGA المكرسبل في الأسيتونيتريل بتركيز 5 millimolar مع التقليب اللطيف.

ثم أضف كمية كافية من NHS وEDC للحصول على تركيزات تبلغ 25 millimolar، مما يوفر فائضاً ستوكيومترياً بمقدار خمسة أضعاف مقارنة بـ PLGA. حرك المحلول برفق لمدة ساعة تقريباً للسماح بتحويل كربوكسيلات PLGA إلى PGA NHS. بعد مرور ساعة واحدة، قم بترسيب ناتج تفاعل PGA NHS عن طريق إضافة محلول الغسيل الميثانول بحجم يزيد تقريباً عن 10 أضعاف حجم المحلول. قم بطرد المحلول مركزياً عند 2000 ×g لترسيب P-L-G-A-N-H-S، وبعد الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي لإزالة آثار EDC وNHS. تكرر عملية الغسيل بالميثانول هذه ثلاث مرات على الأقل.

بعد اكتمال عملية الغسل، يتم تجفيف P-L-G-A-N-H-S تحت vacuum لمدة 30 دقيقة لإزالة أي آثار لمحلول الغسل. الآن، أعد إذابة حبيبات P-L-G-A-N-H-S في aceto NI trial بنفس التركيز الذي استُخدم في البداية لإذابة PLGA.

بمجرد الذوبان، أضف PEG ثنائي الوظيفة غير المتجانس إلى محلول PLGA. أضف تركيزاً مقداره 5 millimolar.

حضّن المحلول المخلوط لمدة 24 ساعة مع التقليب المستمر. قم بترسيب ناتج تفاعل البوليمر الإسهامي الكتلي PLGA PEG بإضافة الميثانول بكمية فائضة. كرر عملية الغسل والطرد المركزي ثلاث مرات إضافية لإزالة كل كميات الـ peg غير المتفاعلة الزائدة.

كخطوة نهائية في عملية التخليق، جفف البوليمر الإسهامي الكتلي PLGA PEG تحت vacuum. تبدأ عملية ترسيب الجسيمات النانوية بإذابة البوليمر الإسهامي الكتلي PLGA PEG والدواء المراد تغليفه في مذيب A-P-L-G-A. يعد اختيار المذيب أمراً حاسماً لأنه يؤثر على خصائص الجسيمات النانوية. بعد ذلك، أضف خليط البوليمر والدواء، قطرة تلو الأخرى، إلى ثلاثة إلى 10 أحجام من الماء المقلب للحصول على تركيز نهائي للبوليمر يبلغ حوالي 3 mg/mL. قطرة تلو الأخرى.

تعد إضافة المحلول العضوي إلى الطور المائي أمراً بالغ الأهمية لتكوين جسيمات نانوية بالحجم الصحيح. استمر في التقليب لمدة ساعتين تحت ضغط منخفض للسماح للجسيمات النانوية بالتكون عن طريق التجميع الذاتي ولإزالة آثار المذيب العضوي. بعد ساعتين من التقليب.

قم بتركيز الجسيمات النانوية عن طريق الطرد المركزي عند 2,700 ×g لمدة 10 دقائق باستخدام مرشح Amon. ثم اغسل الجسيمات النانوية بمحلول PBS لإزالة أي دواء غير محبوس، متبوعاً بعملية طرد مركزي. وأخيراً، أعد تشكيل الجسيمات النانوية في محلول PBS عند هذه النقطة.

يمكن إجراء توصيف بيوفيزيائي أساسي، بما في ذلك الحجم، والشحنة السطحية، وكفاءة تحميل الدواء، لفهم خصائص الجسيمات النانوية بشكل أفضل. يمكن تخزين الجسيمات النانوية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب؛ ولتوصيف جسيمات PLGA PEG النانوية، استُخدم المجهر الإلكتروني النافذ للتأكد من حجم الجسيمات النانوية وتوزيعها وبنيتها. يكون حجم الجسيمات عموماً في نطاق النانومتر.

قد تشير أحجام الجسيمات الكبيرة مع توزيعات حجمية غير متساوية إما إلى خطأ في تفاعل الاقتران أو إلى أن طريقة الترسيب النانوي تحتاج إلى تحسين. يظهر هنا دراسة لحركية إطلاق الدواء حيث تم قياس كفاءة تحميل Paclitaxel وإطلاقه باستخدام تقنية HPLC القياسية. وقد خضعت كميات محددة ومعلومة من الجسيمات النانوية لعملية الديلزة في فواصل زمنية محددة.

تم جمع المحتوى الموجود في وحدة الديلزة وإضافة حجم مساوٍ من المذيب العضوي لإذابة الجسيمات النانوية. بعد ذلك، تم إجراء تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) على هذه العينات. ولقياس كمية الـ Paclitaxel، يمكن تنفيذ تقنية الترسيب النانوي هذه بشكل صحيح في غضون ثلاث ساعات بمجرد إتقانها.

تذكر عند تنفيذ هذه التقنية إضافة الطور العضوي دائمًا ببطء إلى الطور المائي لمنع تكون جسيمات كبيرة بعد تطويرها. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السرطان في مجال الطب النانوي لاستكشاف استخدام الأدوية ضعيفة الذوبان التي كانت تُعتبر ذات مرة شديدة السمية للمرضى المصابين بالسرطان عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى، مثل دراسات الفعالية داخل الجسم الحي (in vivo) أو دراسات التصوير، للإجابة على تساؤلات مثل ما إذا كانت الأدوية ضعيفة الذوبان فعالة عندما لا تعود السمية الجهازية مشكلة، أو ما إذا كانت ربيطات الاستهداف توجه الجسيمات النانوية بشكل صحيح إلى وجهتها.