التوافقي النانوية للبحوث التجديدي

الهدف العام من التجربة التالية هو المراقبة المختبرية لمجموعات الخرز القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الوقت الفعلي ثلاثي الأبعاد والدقة المكانية العالية. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الجنينية وتوسيعها أولا حتى تشكل أجسام Embry. بعد ذلك ، يتم تشريح مجموعات الضرب وطلاءها على مرشحات مسامية POLYTETRAFLUOROETHYLENE أو PTFE ، مما يسمح بالحفاظ عليها كهواء طويل الأجل.

يتم تصنيف الثقافات السائلة ثم العناقيد الضاربة بجسيمات نانوية توافقية من أجل إجراء فحص مجهري متعدد الفوتون في الوقت الفعلي. تسمح النتائج التي تم الحصول عليها بتحليل الاستطالة المكانية وتكرار الانقباضات القلبية على النطاق المجهري. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه الجسيمات النانوية هي أنه يمكنك استخدام أي طول موجي ، خاصة الأشعة تحت الحمراء ، حتى تتمكن من التعمق في الأنسجة وهي أيضا مستقرة جدا بمرور الوقت.

حتى نتمكن من مراقبة عملياتنا الطويلة على مدى أطر زمنية طويلة. يمكن أن تساعد طريقة زراعة الخلايا الجذعية هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الانقباض الوظيفي لخلايا عضلة القلب في ثلاثة أبعاد. على وجه الخصوص ، نضوج القلب وهندسة الأنسجة.

يجب أن يدرك الأفراد طريقة المرض الجديدة أن إجراء وضع العلامات مع الجسيمات النانوية التوافقية لا يمكن استخدامه إلا للفحص المجهري متعدد الفوتون ولا يمكن نقله إلى نوع آخر من أنظمة التصوير. خطرت لنا لأول مرة فكرة استخدام الجسيمات النانوية التوافقية في عام 2005. تقدم هذه الجسيمات النانوية مزايا فيما يتعلق بالأصباغ الفلورية والنقاط الكمومية.

في الواقع ، لا تتلاشى إشارتهم بمرور الوقت ويمكن استخدامها لمراقبة العينات النامية على مدى فترات زمنية طويلة. يعد العرض المرئي لتحضير العينة أمرا بالغ الأهمية لكفاءة الخطوات المختلفة وقابليتها للتكرار ، لا سيما عند إجراء اختبار المخدرات ويمكن أيضا تطبيقه على أنسجة أو أمراض مختلفة. نمذجة الأنسجة.

بعد زراعة وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الجذعية الجنينية وفقا لبروتوكول النص واحتضانها بالكولاجيناز الدافئ ، أربعة لمدة 10 دقائق ، اجمع شظايا المستعمرة في ملليلترين من التمايز الطازج ، متوسط أو DM وأجهزة الطرد المركزي عند 115 ضعف الجاذبية لمدة ثلاث دقائق. الثقافة ، تقطع المستعمرة في تعليق في مرفقات منخفضة للغاية. ست ألواح آبار لمدة أربعة أيام للسماح لها بتكوين أجسام جنينية أو ebs.

ثم قم بوضع EBS المشكل حديثا على 0.1٪ مغلفة بالجيلاتين 24 لوح بئر لمدة 15 إلى 30 يوما حتى ظهور مجموعات الضرب. قم بإزالة PBS وباستخدام acutus ، وفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة بعد الطرد المركزي وإعادة التشكيل ، مع تعليق الخلايا في لوحة DM المتوسطة ملليلتر لكل agro. غرفة البئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية ليوم واحد.

اجمع EBS المشكلة حديثا واللوحة ثلاثة لكل بئر على 0.1٪ مغلفة بالجيلاتين 24 لوحة بئر بعد أسبوعين إلى أربعة أسابيع في المزرعة. حدد مجموعات خلايا عضلة القلب النابضة واستخدم ماصة معجون ممدودة مقطوعة بشكل حاد ، وقم بتشريحها يدويا. قم بإيداع أربعة مرشحات PTFE لكل ملحق وضع كل منها في بئر من ستة ألواح آبار.

بعد إضافة مليلتر واحد من DM إلى كل منها ، أضف مجموعة خفق واحدة مشرحة إلى كل مرشح PTFE. لتسمية المجموعات ، انقل مرشحات PTFE مع مجموعات الضرب إلى طبق زجاجي قاع بطول 3.5 سم. أضف ملليلترا واحدا من الجسيمات النانوية من الجيل التوافقي الثاني عند 50 ميكروغراما لكل مليلتر واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإجراء التصوير البصري غير الخطي.

بعد نقل مجموعات HEBs أو مجموعات ضربات القلب المسمى إلى غرفة التصوير ، استخدم التصوير الواسع المجال تحت إضاءة الضوء الأبيض لتحديد الهياكل ذات الأهمية داخل EBS المتمايزة أو مجموعات الضرب النشطة. قم بإجراء مسح ثلاثي الأبعاد سريع منخفض الدقة لإعادة بناء التشكل الكلي لمجموعة القلب وتحديد مستوى صورة داخل حجم العنقود مع العديد من الجسيمات النانوية التوافقية الثانية المرئية لمراقبتها في الوقت الفعلي. تضع تقلصات الكتلة القلبية الماسح الضوئي المجهري في أسرع وضع ، مما يسمح بالحصول على صور ثنائية الأبعاد متعددة الهرتز.

قم بتحليل الصور باستخدام برنامج MATLAB وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح هنا قبل تقييم نشاط الضرب. يتم إجراء توصيف الاستجابة البصرية غير الخطية لمرشحات PTFE للتأكد من أن الركيزة العارية لمضان الفوتون ضعيفة جدا ولا يمكن أن تمنع قياس العينات البيولوجية ذات الصلة والانبعاث من المعزول. يمكن الحصول على الجسيمات النانوية من الجيل الثاني بسهولة عن طريق التصوير من خلال الركيزة في وضع الكشف عن epi.

في هذا الشكل ، يتم عرض الجسيمات النانوية التوافقية الثانية المسماة هياكل القلب و EBS على شكل شفرة. تتوافق الألوان الحمراء والصفراء والخضراء مع التألق الذاتي NADH بينما تنبع البقع التوافقية الثانية الزرقاء الكثيفة من الجسيمات النانوية من الجيل الثاني المعزولة. لاحظ التباين البصري الجيد ووضع العلامات المتناثرة نسبيا مقارنة بالنقاط الكمومية أو الجسيمات النانوية ذات التحويل الأعلى.

هذا الشكل عرضا لشريحة من الجيل التوافقي الثاني للجسيمات النانوية المسماة مجموعة النبضات القلبية. كما هو موضح في هذا الفيلم ، يتم تسجيل الهياكل ثلاثية الأبعاد بسرعة عالية لمراقبة نمط الانكماش في الخلية الثانية. تتجمع الجسيمات النانوية للتوليد التوافقي للحفاظ على معدل سرعة اكتساب مرتفع لحل حركة NP.

تكن حساسية الاستحواذ الإجمالية كافية لتسجيل التألق الذاتي للخلية مع الانبعاث التوافقي الثاني من الجيل التوافقي الثاني. يشير تحليل صورة الجسيمات النانوية التي يتم إجراؤها على إطارات الأفلام إلى أنه داخل نفس إزاحة الكتلة القلبية في حدود بضعة ميكرومترات ، والتردد ثابت لداخل وخارج حركة الجسيمات النانوية من الجيل الثاني العادي. عند إتقان تقنية تحضير الخلية ، تقوم مجموعة الرهان بتشريح مزرعة سائل الهواء ويمكن إجراء الحمل في غضون 24 إلى 36 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

خاصة مع هذه التقنية ، يجب تجنب ملامسة الهواء الطلق لمنع التلوث. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمرء تطبيق طرق أخرى مثل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام مصفوفات أقطاب كهربائية متعددة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ربط ملفات تعريف جهد الفعل بتردد الضرب في ثلاثة أبعاد. يمكن تطوير تقنيتنا الجديدة القائمة على اكتشاف الإشارة غير الخطية بواسطة الجسيمات النانوية التوافقية بشكل أكبر من أجل الدراسات في الجسم الحي تصيب الأطوال الموجية المستخدمة للتصوير تسمح باختراق أعمق في الأنسجة.

يمكن أن يكون أحد التطورات المحتملة هو اتباع تكامل البنية المشتقة من الخلايا الجذعية لتطبيقات الطب التجديدي.