رصد المشقوق كاسباس 3 النشاط وموت الخلايا المبرمج للخلايا Oligodendroglial مخلد باستخدام خلايا حية التصوير وCleaveable ركائز Fluorogenic صباغة وبعد زوال الاستقطاب الناجم عن غشاء البوتاسيوم

تسمح هذه العملية بمراقبة موت الخلايا الدبقية في استجابة إصلاح الحمض النووي (DDR) للـ oligo في الوقت الفعلي. ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة الخلايا أولاً، ثم تحضيرها للتصوير الحي للخلايا. وتتمثل الخطوة التالية في تقديم معالجة للخلايا ومراقبة التأثيرات باستخدام المجهر الفلوري.

تتمثل الخطوة النهائية في إجراء تحليل البيانات. وفي النهاية، تُظهر النتائج معدلات موت الخلايا في مجموعة من الخلايا بعد التعرض لعلاج أو محفز، وذلك من خلال مراقبة الفلورة النووية باستخدام صبغة فلورية يتم تنشيطها بواسطة caspase. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التلوين المناعي، في القدرة على جمع بيانات من نقاط زمنية متعددة في آن واحد.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة عن أسئلة رئيسية في بيولوجيا الخلية، مثل الاستجابات للعلاجات الدوائية والكيميائية ومختلف المعالجات الأخرى. والآن، يمكن لهذه الطريقة تقديم رؤى حول الموت داخل المزارع الخلوية. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الأنسجة خارج الجسم (ex vivo) والأنسجة العضوية، بما في ذلك شرائح الدماغ.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات أثناء تكيفهم مع العمل على الأنسجة الحية بدلاً من الأنسجة المثبتة. ويعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً هاماً نظراً لوجود العديد من الخطوات لتحضير عينات الخلايا الحية مقارنة بالأنسجة المثبتة. أولاً، يتم إذابة خلايا N 19 oligo droog glial المخلدة والمجمدة في حمام مائي عند 37 degree Celsius أثناء عملية إذابة الخلايا.

أضف سبعة milliliters من وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل بـ 10% FBS و 1% penicillin streptomycin إلى طبق زراعة بمقاس 10 centimeter. ثم أضف معلق الخلايا قطرة تلو الأخرى إلى الطبق وقم برج طبق Petri بلطف لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ. ازرع الخلايا عند 34 degrees Celsius في حاضنة تحتوي على 5 cent carbon dioxide لمدة أربع ساعات.

قم بشفط الوسط من الأطباق لإزالة أي بقايا من DMSO.مادة واقية من التجميد. استبدله بسبعة ملليلترات من وسط طازج بعد أربعة إلى سبعة أيام من النمو. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80%من درجة التلاقي، قم بشفط الوسط وانقل ملليلتر واحد من القطرات إلى طبقة الخلايا، وتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، يتم حصاد الخلايا ثم استزراعها في طبق زراعة أنسجة بقطر 10 سنتيمتر بكثافة 0.1 × 10⁶ خلية/مل، ووضع هذا الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة. وبعد مرور ممر واحد إضافي، يمكن توزيع الخلايا من أجل تجارب تصوير الخلايا الحية. وللقيام بذلك، تُحصَد الخلايا كما سبق، ثم يتم سحب 30 µL من معلق الخلايا وعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).

بعد ذلك، استخدم ملاقط معقمة لوضع شرائح غطاء زجاجية غير مطلية. وفي آبار صفيحة سداسية الآبار، أضف الخلايا إلى البئر بكثافة 0.1 × 10⁶ خلية/مل. في 2 mL من وسط DMEM عالي الجلوكوز الخالي من الفينول والمُدعم بـ 10% FBS و 1% penicillin streptomycin، اترك الخلايا تنمو طوال الليل عند 34 °C و 5% carbon dioxide قبل عملية التعداء.

في اليوم التالي، اخلط 100 µL من الوسط الخالي من المصل مع 0.5 إلى 4 µg من DNA البلازميد المنقى و 4 µL من FUgene HD. قم برج الخليط بلطف باستخدام جهاز الفورتكس مرتين، ثم اترك الـ DNA ليتكون المعقد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد انقضاء وقت الحضانة، أضف خليط FUgene HD و DNA مباشرة إلى الخلايا المستزرعة.

أمل الطبق برفق للمزج. ثم قم باستزراع الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 34 درجة مئوية و 5% carbon dioxide قبل البدء في المعالجة أو التجربة. أولاً، قم بتشغيل صندوق التحكم في جهاز LCI Cham light لتصوير الخلايا الحية.

يجب القيام بذلك قبل ثلاث ساعات من بدء التجربة لضمان تدفئة المنصة بشكل كامل. وكحد أدنى، يجب تشغيل صندوق التحكم قبل ساعة واحدة من بدء التجربة. بعد ذلك، وأثناء العمل داخل غطاء التدفق الصفحي، قم برش غرفة الزرع المغناطيسية من نوع LCI Cham light والملاقط بـ 70%ethanol واتركها تجف لمدة خمس دقائق.

أخرج الخلايا من الحاضنة وافحصها تحت المجهر للتأكد من سلامتها. يجب أن تبدو الخلايا حيوية ومبسوطة جيداً على شريحة الغطاء الزجاجية مع وجود العديد من الزوائد الغشائية. من المرجح أن تكون الخلايا التي تعاني من نقص في عدد الامتدادات الزوائدية أو ذات نواة غير منتظمة الشكل مجهدة بسبب عملية عفن الخلية (transfection)، وبالتالي فهي غير مناسبة للتجارب اللاحقة التي تُجرى داخل كابينة التدفق الصفحي.

أمل طبق الستة آبار وقم بإزالة الشريحة الغطائية باستخدام الملقط. ضع الشريحة الغطائية بسرعة في الطبق السفلي من الحجرة بحيث يكون وجه الخلية للأعلى. لا تسمح بجفاف الشريحة الغطائية.

بعد ذلك، قم بتثبيت الجسم الرئيسي المغناطيسي لغرفة الزرع وأضف 500 µL من الوسط الغذائي من طبق الستة آبار الأصلي فوق غطاء الشريحة. إن إعادة استخدام الوسط الغذائي تقلل من مقدار الإجهاد الواقع على الخلايا والناتج عن التغيرات البيئية، كما يمكن أن تكون مفيدة لتقييم العوامل المفرزة خارج الخلية. بعد إضافة الوسط الغذائي، ضع الغطاء الزجاجي على غرفة الزرع واستخدم منديل Kim wipes مبللاً بـ 70% لإزالة أي مواد متبقية من أسفل غطاء الشريحة قد تتداخل مع الفحص المجهري.

ضع غرفة الزرع في الحاضنة عند درجة حرارة 34 degrees Celsius و5%carbon dioxide لمدة 30 دقيقة. ستضمن هذه الخطوة أن تسخن الغرفة نفسها لتصل إلى 34 degrees لتقليل إزاحة غطاء الشريحة. وبينما يسخن المعدن، من الضروري العمل في إضاءة غرفة محيطة منخفضة قدر الإمكان خلال الخطوات التالية.

أولاً، قامت ثورا مسبقاً بتحضير محلول nuke view في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استخرج غرفة الزراعة من الحاضنة وضعها بسرعة في الغرفة البيئية للمجهر. قم بتشغيل خزان ثاني أكسيد الكربون المخلوط مسبقاً بنسبة 5% المزود بمنظم مزدوج.

بعد ذلك، يتم استخدام الشيئية 10x مع ضبط مصباح المجهر عند حوالي 2.5 فولت ووقت التعريض على 240 milliseconds. يتم الضبط البؤري باستخدام مجهر الحقل المضيء (brightfield microscopy) لرؤية الخلايا على شاشة الكمبيوتر. ثم يُضاف تركيز 80 millimolar من أيونات البوتاسيوم أو أي محفز آخر للموت الخلوي المبرمج (apoptosis inducer) إلى الخلايا عبر استبدال الوسط الغذائي مع إجراء تروية محلية وبطيئة باستخدام مضخة 연동ية (peristaltic pump).

تعتبر الركيزة nuke view 4 88 مستقرة في المزارع الخلوية للتجارب التي تستمر لمدة تصل إلى 36 ساعة. وبناءً على ذلك، يمكن إجراء التجارب على مدار هذه الفترة الزمنية. أولاً، قم بضبط المجهر لرؤية الفلورة الصادرة عن البروتين الفلوري الأحمر والأخضر.

بعد ذلك، انقر فوق القناة الحمراء لعرض الخلايا المنقولة. اختر واحفظ ما يقرب من 12 إطاراً تظهر فيها عدة خلايا منقولة، واحفظ نقاط منصة XY هذه. اضبط المجهر لالتقاط الصور في القناة الحمراء في المجال المضيء والقناة الخضراء عند نقاط المنصة المحفوظة هذه كل ست دقائق.

بعد جمع نقاط XY متعددة من تجارب مكررة مرتين أو ثلاث مرات، قم بتجميع البيانات من التجارب المنفصلة التي أجريت في أيام مختلفة، وأجرِ تحليل البيانات والاختبارات الإحصائية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب لمقارنة نسبة الخلايا السالبة لـ CASP bay إلى الخلايا الموجبة لـ CASP bay. يمكن أن يشير Nuke view 4 88 substrate إلى زيادة معدل موت الخلايا المبرمج (apoptosis) في مستنبتات الخلايا الدبقية N 19 oligo DDR. وقد تم الحصول على صور الخط الأساس هذه باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 10 مرات، وذلك بعد المعالجة بتركيز عالٍ من البوتاسيوم خارج الخلوي.

تم ترانسفكشن خلايا N 19 ببروتين RFP، ثم عولجت إما بـ 3 µL من ركيزة nuke view 488 للخلايا الضابطة، أو بـ 3 µL من ركيزة nuke view 488 مع 80 millimolar من البوتاسيوم. وتوضح هذه الصور أن عدد الخلايا الموتة مبرمجاً يزداد بمرور الوقت، وتحديداً بعد 3 و6 و9 ساعات من المعالجة بـ 80 millimolar من البوتاسيوم؛ بينما لم تُلاحظ كميات كبيرة من الموت الخلوي المبرمج في الظروف الضابطة مقارنة بالمزارع المعالجة بـ 80 millimolar من البوتاسيوم. وتشير إشارة الخلفية الخضراء الملحوظة في الظروف الضابطة إلى الخلايا التي تمر بعملية الموت الخلوي المبرمج دون إضافة بوتاسيوم خارجي.

تعتبر الفترة الزمنية التي تبلغ 12 ساعة كافية للدراسات التي تتضمن الإصابات العصبية. فبعد مرور 12 ساعة، أظهرت المزارع المعالجة بالبوتاسيوم موتًا خلويًا بنسبة 45% تقريبًا. ولم تظهر أي من الخلايا في تجربة الضبط الموت الخلوي المبرمج (apoptosis) بحلول النقطة الزمنية 12 ساعة. وعلى الرغم من ذلك، قد تتطلب التجارب في حالات أخرى فترة تشغيل أطول.

يوضح هذا الرسم البياني الزيادة في الخلايا الموجبة لـ caspase three على مدار المسار الزمني للتجربة التي استغرقت 12 hour. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة، كما يمكن جمع البيانات طوال الليل إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على الاتساق بين المعالجات عند اتباع هذا البروتوكول.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل التصبيغ المناعي، لفحص البروتينات النهائية الأخرى المشاركة في المسارات المدروسة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات للتصوير. قم بجمع مجموعة بيانات ثم قم بتحليل بياناتك.