تصوير الخلايا الحية لنفاذية الغشاء الليزوزومي أثناء داء الننوبات

يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير الخلايا الحية لمراقبة نفاذية الغشاء الليسوزومي أثناء النكروتسومي باستخدام مجسات فلورية تكشف عن التغير في سلامة الغشاء الليسوزومي والتحموض. التحدي في هذا المجال هو توصيف ديناميكية العضيات المتضررة خلال عملية موت الخلية، وتحديد بدقة كيف يجب أن يؤدي هذا الضرر إلى التسبب في زوال الخلية. للبدء، قم بوضع 5,000 خلية في ملليلتر من وسائط DMEM المكملة بالمضادات الحيوية في طبق زجاجي معقم.

ضع الطبق في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وحضن الخلايا طوال الليل. أضف 20 ميكرولتر من حبيبات الديكستران الخضراء إلى 25 ميكروغرام لكل ملليلتر في وسط DMEM مكمل للمضادات الحيوية لتخفيفه. أزل الوسط القديم من الطبق واستبداله بملليلتر من مادة DMEM المكملة التي تحتوي على لحم البقر.

ضع الطبق في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وحضن الطبق لمدة 24 ساعة للسماح بإدخال الخرزات إلى الليسوسومات. الآن أضف ميكرولترين من محلول LysoTracker ذو المخزون بحجم ملليمولر واحد إلى مليليترين من وسط DMEM الطازج. استبدل الوسط القديم بمحلول التلوين هذا.

حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. قم بتشغيل مكونات النظام الكونفوكلي بتشغيل الحاسوب الشخصي، المجهر، طاقة الماسح الضوئي، طاقة الليزر، انبعاث الليزر، وطاقة لايكا. شغل أدوات التحكم البيئية، بما في ذلك وحدة التحكم في درجة الحرارة المسماة Cube، ووحدة تحكم خلاط غاز ثاني أكسيد الكربون المسماة Brick.

افتح ثاني أكسيد الكربون وإمداد الأكسجين. اضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. اضبط وحدة تحكم الغاز والرطوبة على 5٪ ثاني أكسيد الكربون و95٪ رطوبة.

قم بتجميع غرفة التصوير. بعد التلوين، اغسل الخلايا ثلاث مرات بجرعة ملليلتر من PBS، ثم أضف ملليلترين من وسائط DMEM الطازجة المكملة. ضع زيت الغمر على العدسة الموضوعية قبل التصوير.

ثبت الطبق على منصة المجهر. اضبط شدة الليزر حتى 3٪ ولكن لا تزيد عن 5٪ ثم اضبط كسب الكاشف في برنامج المجهر لتحسين الإشارة. قم بتقليل الخلفية عن طريق ضبط شريط التباين.

احصل على صور أساسية للخلايا غير المعالجة، والتي تعمل كحالة تحكم. أعد اللوحة إلى غطاء تدفق الطبقات وأضف مضاد حيوي واحد من ملليلتر DMEM مع محفزات موت الخلايا. في برنامج الاكتساب، ضبط الوضع على XYT، تنسيق على 512 في 512، السرعة على 400، التكبير إلى ثلاثة، متوسط الخط على واحد، تراكم الخط على ثلاثة، تراكم الإطار على واحد، الفترة الزمنية إلى ثلاث دقائق، المدة إلى ثماني ساعات، وفعل التركيز التلقائي.

انقر على ابدأ لبدء عملية الاستحواذ على اللحظات الزمنية. أكد التصوير الأولي وجود نقاط مستقرة من LysoTracker وديكستران الموسوم بالفلوريساين، مما يشير إلى وجود ليسوسومات سليمة قبل العلاج. بعد أربع ساعات من العلاج ب TSZ، انخفض تألق LyoTracker بشكل ملحوظ، بينما بدأ الديكستران يظهر توزيعا سيتوصوليا منتشرا، مما يشير إلى نفاذية الغشاء الليسوزومي الأولية.

بحلول ثماني ساعات من العلاج، اختفت إشارة ليزوتراكر تقريبا بالكامل، بينما احتفظت العديد من الخلايا بنقاط الزاوية الخضراء الديكسترن مع إشارة سيتوصولية خضراء منتشرة. نثبت أن نفاذ الغشاء الليسوزومي يمكن رؤيته مباشرة في خلية حية تخضع لعملية تحفيز نيكروبتوتيكية. يظهر هذا البروتوكول أن الجمع بين كل من LysoTracker وخرز الدكستران يتيح مراقبة pH وإطلاق الحمولة في الوقت الفعلي في الوقت الواحد.

ومن المهم لتقدم هذا البروتوكول لصورة الخلايا الحية هو قدرته على مراقبة تغير بسيط في الحموضة ونفاذية الغشاء الليسوزومي في الوقت الحقيقي، مع التقاط الأحداث الديناميكية التي تغفل عن تحليل النقاط النهائية مثل قياس التدفق الخلوي والتلوين أحادي الطبقة.