عزل LacZ - معربا عن خلايا من أنسجة الأذن الداخلية باستخدام الماوس التدفق الخلوي

الهدف العام من التجربة التالية هو عزل الخلايا الموجبة لـ lax Z من قوقعة الفأر حديث الولادة باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل عدد كبير من قواقع الفئران في إطار زمني قصير نسبياً للحفاظ على حيوية الخلايا وتوفير أنسجة بدائية كافية. وفي الخطوة الثانية، يتم تفكيك الخلايا الموجبة لـ LAX Z ثم وسمها لتجهيز النسيج لعملية الفرز.

يتم بعد ذلك فرز الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي. ومن ثم يمكن استخدام مجموعات LAX Z high و lax low الناتجة لإجراء المزيد من التجارب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث الأذن، مثل ما هي الملامح الجينية أو مجموعات الخلايا المحددة داخل الأذن الداخلية.

سيقوم الطالب في كلية الطب طه جين أ من مختبرنا بتوضيح الإجراء. أولاً، املأ أطباق بتري بقطر 35 مليمتر بمحلول HBSS وضعها على قالب من الثلج. ثم استخدم مقص القزحية لفصل رؤوس 12 إلى 15 فأراً من نوع axon، 2 laxy reporter والفئران البرية (wild type)، بعد القتل الرحيم، والتي يتراوح عمرها بعد الولادة من صفر إلى ثلاثة أيام.

ضع الرؤوس في طبق بتري بقطر 60 مليمتر فوق قالب من الثلج. بعد ذلك، استخدم ملقط Dumont رقم 5 ومقص القزحية لاستئصال الفك السفلي واللسان من الرؤوس، ثم اقطع قاعدة الجمجمة عند مستوى الحنك. الآن قم بإزالة الجلد المغطي للجمجمة واقطع قاعدة الجمجمة عن طريق إدخال المقص عند الجزء السفلي من الثقبة العظمى وصولاً إلى منتصف الحنك.

قم بإجراء شق آخر باستخدام المقص من الحافة المقطوعة للحنك إلى الجانب العلوي من القالب على كلا الجانبين، مع الحرص على عدم إتلاف المحفظة الأذنية. ثم استكمل عزل العظم الصدغي عن طريق إجراء شقين بزاوية 45 درجة، بدءاً من الجانب العلوي للإطار والثقبة العظمى وصولاً إلى القطع الإكليلي عند الحنك الصلب.

بعد ذلك، ضع العظام الصدغية المعزولة في أطباق بيتري قياس 35 مليمتر التي تحتوي على HBSS على كتلة الثلج، وانقل كتلة الثلج إلى غطاء تشريح معقم. بعد ذلك، املأ طبق بيتري آخر قياس 35 مليمتر هذه المرة بمحلول PBS وضعه فوق كتلة الثلج. وباستخدام ملقطين من المقاس 55.

ابدأ عملية التشريح المجهري بإزالة القشرة وجذع الدماغ والمخيخ برفق من العظم الصدغي الذي يعلو المحفظة الأذنية. بعد ذلك، وبدون إزالة المحفظة الأذنية، قم بتكسير أجزاء من المحفظة القوقعية بدءاً من مدخل العصب القوقعي الدهليزي والاستمرار داخل المحفظة الأذنية. وعقب كشف قاعدة القوقعة، اسحب عضو كورتي والأنسجة المحيطة به برفق.

ثم ابدأ من القاعدة، وقم بإزالة أي بقايا من العقدة الحلزونية والشريطة الوعائية، وانقل القوقعة إلى طبق بتري المملوء بـ PBS. أولاً، ضع 50 µL من PBS المعقم في مركز بئر أو بئرین من أطباق الزراعة غير المطلية ذات الستة آبار. ثم انقل ما لا يزيد عن 20 قوقعة إلى كل قطرة من PBS.

بعد ذلك، يتم تدفئة حصص مقدارها 50 µL من trypsin بتركيز 0.125% لمدة دقيقتين تقريبًا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C. ثم يُضاف trypsin إلى القوقعة، مع الحرص على عدم هز الطبق.

يُحضن القوقعة عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق. يتم إيقاف عملية الهضم بالتريبسين عن طريق إضافة 50 µL من مثبط تريبسين فول الصويا إلى كل قطرة، ثم تُضاف 50 µL إضافية من الوسط الغذائي الكامل بعد ضبط الماصة P 200 على 125 µL. تُستخدم طرف ماصة غير حادة سعة 300 µL لتقليب الخلايا برفق 80 مرة مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.

بعد ذلك، وبعد سحق كل قطرة، أضف 200 µL إضافية من الوسط الغذائي الكامل إلى كل منها. الآن، مرر الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 micron إلى بئر جديدة في نفس طبق الستة آبار، ثم انقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب fax قياسية منفصلة.

بعد ذلك، أضف 100 µL من الخلايا من النوع البري (wild type) في كل من ثلاث أنابيب، متبوعاً بالتخفيف باستخدام 300 µL من الوسط الغذائي الكامل لمجموعة CUG فقط. بالنسبة لمجموعة التحكم، قم بتخفيف 10 µL من axon، وخليتين من LAX Z في 390 µL من الوسط الغذائي الكامل. انقل ما تبقى من axon وخليتين من lax Z إلى أنابيب fax في 400 µL من OTs.

بعد ذلك، وبعد تحضين الأنابيب في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق، أضف 200 µL من CUG المخفف إلى كل أنبوب fax مناسب. بعد ذلك، ومع حماية جميع الأنابيب من الضوء، يتم تحضين الخلايا في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 25 دقيقة. ومن أجل عملية التلوين أثناء تحضين الخلايا، ضع 10 mL من heaps + FBS المُحضّر حديثاً في أنبوب سعة 15 mL وضع الأنبوب على الثلج.

بعد ذلك، أضف 1.8 milliliters من محلول heap المبرد بالثلج إلى كل أنبوب من أنابيب fax تحت غطاء التعقيم مع إطفاء الأنوار لتقليل التعرض للضوء. تالياً، قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1200 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الرواسب في 300 microliters من الوسط الغذائي الكامل.

اجمع جميع الحصص الموزعة لعينة الفرز، ثم أضف يوديد البروبيديوم إلى كل أنبوب مناسب ليصل التركيز النهائي إلى 1 µg/mL. وأخيرًا، بعد تغطية الخلايا، ضعها مرة أخرى على الثلج. قم بضبط بوابات الفرز من خلال جمع 1000 حدث من خلايا النوع البري غير المصبوغة أولاً لتحديد توزيع الخلايا على مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي.

اضبط معلمات التشتت الأمامي والجانبي حسب الضرورة. ثم قم بإجراء التعويض باستخدام النوع البري غير المصبوغ، والنوع البري المصبوغ بـ PI، والمحوار المصبوغ بـ CUG. خليتان من نوع LAX Z.

املأ أنبوبي اختبار بـ 500 µL من الوسط الغذائي الكامل. ثم ابدأ التحليل باستخدام خلايا النوع البري المصبوغة بـ PI وخلايا Lae CUG المصبوغة بـ axon 2، مع ضبط البوابة لاستبعاد الحطام الخلوي بناءً على مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي. استبعد الخلايا المزدوجة والتكتلات باستخدام مخطط ارتفاع التشتت الأمامي مقابل مساحة التشتت الأمامي.

بعد ذلك، استبعد الخلايا الميتة الموجبة لـ PI بناءً على مخطط مساحة التشتت الأمامي مقابل مساحة PE sci five. لكل وضعية بوابة، قم بإعداد مخطط لمساحة التشتت الأمامي مقابل مساحة cascade أو Pacific blue. قم بتحليل 10,000 حدث من أنبوب عينة الفرز التي تحتوي على خلايا مصبوغة بـ axon two laxy و PI و CUG، وذلك باستخدام جميع البوابات التي تم ضبطها باستخدام خلايا النوع البري (wild type) وباستخدام المخططات المستخرجة من خلايا النوع البري.

قم بإنشاء بوابات للخلايا ذات الفلورية العالية بصبغة cascade blue والتي تشكل أقل من 1% من إجمالي عدد الأحداث. يجب أن تحتوي بوابات Cascade Blue High الآن على حوالي 15 إلى 20% من الخلايا في عينة Axon two laxy. بعد تحديد هذه الخلايا العالية من Axon two باستخدام مخطط تحليل خلايا Axon two laxy، قم الآن بإنشاء بوابة للخلايا الأقل فلورية بنسبة 15 إلى 20% باستخدام استراتيجية تحديد البوابات المذكورة سابقاً.

قم بفرز الخلايا في أنابيب fax التي تحتوي على وسط غذائي كامل، مع الحفاظ على أنابيب التجميع في غرفة مبردة عند درجة حرارة 4 °C أثناء عملية الفرز. سجل عدد الخلايا التي قام جهاز قياس التدفق الخلوي بعدّها لكل مجتمع خلوي في هذين الشكلين: مساحات التشتت الجانبي مقابل مساحات التشتت الأمامي للنوع البري المفكك على اليسار و axon two LA Z على اليمين.

تظهر هنا خلايا القوقعة. لاحظ عملية تحديد البوابات (gating) للمجموعات المتميزة من الأحداث التي تكون أكبر حجماً بكثير من تلك الأحداث القريبة من محور Y والمصنفة كجمهرة خالية من الحطام. عادةً ما يتم استرداد 40 إلى 45% من الخلايا الخالية من الحطام من كل من القوقعة البرية (wild type) وقوقعة axin two LAX Z في هذين اللوحين.

يُستخدم ارتفاع التشتت الأمامي مقابل مساحة التشتت الأمامي لاستبعاد الثنائيات من الحطام الذي تم تحديده مسبقاً في البوابة. كما يتم استبعاد أحداث المجموعات السلبية التي تنحرف عن الطبيعة الخطية المتوقعة للمخطط. وتؤدي هذه العملية عادةً إلى الحصول على 71.1% من الأحداث ضمن البوابة المحددة هنا.

يُستخدم يوديد البروبيديوم، كما تم رصده بواسطة قناة PE SCI الخمسية، لاستبعاد الخلايا الميتة كما هو ملاحظ في مخططات التشتت هذه. كانت حوالي 95% من الخلايا المفروزة حيوية ولم تمتص PI في هذه اللوحات. واستُخدمت قناة Cascade blue للكشف عن الركيزة الفلورية CUG كما هو موضح في الشكل الموجود على اليمين.

في المتوسط، تكون أعلى 20% تقريبًا من الخلايا الموجبة لـ CUG هي خلايا lae عالية، والتي ترتبط بنحو 15,000 خلية axon، أي خليتان عاليتان لكل 10 إلى 12 حيوانًا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وعزل الخلايا ذات المستوى العالي من laxy باستخدام قياس التدفق الخلوي من أنسجة الأذن الداخلية، وذلك من أجل تجارب cell Turing وتجارب أخرى مثل التوصيف الجيني.