الكهربائية الميدانية التي تسيطر عليها هجرة إخراج من الخلايا العصبية السلف في البيئات 2D و 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل تأثير المجالات الكهربائية المطبقة على هجرة الخلايا السلفية العصبية في المزارع ثنائية الأبعاد (2D) ونماذج خارج الجسم (ex vivo) ثلاثية الأبعاد (3D). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل وتوسيع الخلايا السلفية العصبية في المختبر (in vitro). والخطوة الثانية هي تحضير معلق من الخلايا السلفية العصبية أحادية الخلية.

بعد ذلك، ولتجهيز المزرعة ثنائية الأبعاد (2D)، يتم استزراع الخلايا السلفية العصبية في غرف تكتيكية كهربائية مصممة خصيصاً. بدلاً من ذلك، ولتجهيز نموذج ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي، يتم وسم الخلايا السلفية العصبية بـ hooks 3, 3, 3, 4, 2، ثم حقنها في نموذج عضوي لشرائح النخاع الشوكي. وفي النهاية، يتم تطبيق مجال كهربائي على الغرف الكهربائية وإجراء تسجيل بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) لإظهار أن الخلايا السلفية تهاجر نحو المهبط (cathode) للمجال الكهربائي في كل من البيئتين ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر طريقة مبتكرة للتتبع الحي للهجرة المستحثة بالمجال الكهربائي للخلايا الفردية بعد زرعها في نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد (3D organotypic model)، وهو نموذج يشبه إلى حد كبير البيئة الطبيعية. لا تقتصر هذه الطريقة على تقديم رؤى حول تقنية الترحيل الكهربائي وهجرة الخلايا العصبية المزروعة في شرائح النخاع الشوكي فحسب، بل يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل نماذج شرائح الدماغ الصغيرة. لبدء هذا الإجراء، قم بتجهيز شرائح زجاجية بمقاس 22 في 11 مليمتر عن طريق تقسيم شرائح معقمة بمقاس 22 في 22 مليمتر.

اقسم شرائح التغطية ذات السماكة رقم 1 إلى نصفين باستخدام قلم ماسي. بعد ذلك، قم بإنشاء بئر زجاجي قائم بذاته بأبعاد داخلية تبلغ 22 في 10 مليمتر عن طريق لصق أربع شرائح زجاجية عمودية مقاس 22 في 11 مليمتر معاً باستخدام شحم السيليكون المفرغ من الهواء بدرجة عالية، واترك البئر ليجف ويتصلب تماماً طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بتثبيت شريحتين زجاجيتين مقاس 22 في 11 مليمتر بشكل متوازٍ مع بعضهما البعض، مع ترك فجوة قدرها 10 مليمتر عند قاعدة طبق زراعة مقاس 100 مليمتر باستخدام شحم السيليكون.

ثم قم بإحكام إغلاق المنطقة الواقعة بين هذه الشرائط عن طريق تثبيت غطاء زجاجي بمقاس 22 by 22 millimeter باستخدام الشحم السيليكوني. ضع البئر الزجاجي فوق الأغطية الزجاجية بحيث تشكل الجدران الداخلية مساحة محصورة لاستزراع الخلايا. قم بعزل جميع الوصلات ضد الماء باستخدام الشحم السيليكوني.

قم بطلاء هذه المنطقة المحددة بالتتابع باستخدام poly de lycine، يليه laminin كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. في هذا الإجراء، يتم الحصول على أدمغة فئران في المراحل الجنينية من E 14 إلى E 16 ووضعها في وسط D-M-E-M-F 12 الأساسي البارد. بعد ذلك، قم بإزالة السحايا باستخدام مجهر تشريحي.

بعد ذلك، انقل الأدمغة إلى طبق بتري بقطر 35 مليمتر. استخدم ملقطاً دقيقاً لتفكيك الأدمغة إلى شظايا نسيجية، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر.

يتم طرد العينات بسرعة 800 RPM لمدة ثلاث دقائق لإزالة الحطام D. بعد ذلك، تضاف A-D-M-E-M-F 12 التي تحتوي على BFDF و DGF إلى العينات. ثم يتم مزجها باستخدام ماصة سعة one milliliter.

بعد ذلك، يتم الحصول على معلق الخلايا المفردة باستخدام مصفاة خلايا. تُزرع الخلايا في الدوارق بتركيز يتراوح من 20,000 إلى 50,000 خلية لكل milliliter. ثم يتم إجراء تغيير كامل للوسط كل ثلاثة أيام، وهو ما يتضمن طرد الخلايا مركزياً بسرعة 1,300 RPM لمدة خمس دقائق.

يتم التخلص من السائل الطافي، وتعليق الـ PT في وسط غذائي جديد، وإعادة الخلايا إلى القارورة كل ستة أيام بعد مرور خمسة أيام على الأقل. تُنقل الـ NEUROSPHERES إلى أنبوب سعة 15 milliliter ويُجرى لها طرد مركزي بسرعة 1, 500 RPM لمدة خمس دقائق. ثم يتم التخلص من السائل الطافي.

أعد تعليق الراسب في EDTA على دفعات لإنتاج معلق من الخلايا المفردة. وقبل إجراء عد الخلايا، جهز ملليتر واحد من المعلق الذي يحتوي على 10,000 خلية. بعد ذلك، قم بإزالة اللامينين من البئر الزجاجي واتركه ليجف تماماً.

استبدله بـ 1 mL من معلق الخلايا. بعد ذلك، ضع الطبق في الحاضنة عند 37 °C لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح بالالتصاق. وبمجرد أن تصبح الخلايا متلاطمة بشكل كافٍ، قم بإزالة الوسط من الغرفة.

أزل الزجاج بعناية. بعد ذلك، قم بتكوين سقف فوق الخلايا عن طريق تثبيت شريحة غطاء زجاجية معقمة بأبعاد 22 في 22 مليمتر بعناية بين شريطين بأبعاد 22 في 11 مليمتر باستخدام شحم السيليكون. تذكر تغطية الخلايا ببضع قطرات من الوسط الزرعي لتجنب الجفاف.

بعد ذلك، قم بتكوين خزان وسط معزول عند كل طرف من أطراف الغرفة عن طريق إنشاء حاجزين من شحم السيليكون المانع للتسرب يمتدان من أحد طرفي الطبق إلى الطرف الآخر. املأ الغرفة بوسط طازج، مع ضمان تدفق الوسط من أحد الخزانات إلى الآخر. بعد ذلك، أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة للسماح للخلايا بالتعافي.

في الخطوة التالية، قم بتجهيز غطاء لتغطية الطبق عن طريق ثقب ثقبين، بحيث يكون كل منهما فوق كل خزان من خزانات غرفة الهجرة. بعد ذلك، استبدل الوسط الموجود في الغرفة بوسط مستنبت يحتوي على 25 millimeter hippies buffer. ثم انقل الطبق إلى نظام التصوير الذي يتم التحكم في درجة حرارته.

قم بضبط المعاملات التجريبية للتصوير بنظام الفاصل الزمني والتسجيل متعدد المواضع. قم بمحاذاة الغرفة بحيث يكون الكاثود والأنود على اليسار واليمين على التوالي، لضمان أن يتجه متجه المجال الكهربائي أفقياً كما يُرى تحت المجهر وكما يتم تسجيله في نظام التصوير. بعد ذلك، املأ بيكرين.

باستخدام محلول شتاينبرغ (Steinberg). قم بتوصيل دورق منفصل بكل خزان وسط باستخدام الجسور الزجاجية المُحضرة مسبقاً والمملوءة بمحلول آجار شتاينبرغ بتركيز 2%. ثم ضع الأقطاب الفضية المتصلة بمصدر طاقة تيار مستمر (DC) في محلول شتاينبرغ.

في كل دورق، اضبط قرص الجهد في وحدة إمداد الطاقة على الصفر ثم قم بتشغيلها. قم بقياس الجهد عبر غرفة الترحيل الكهربائي باستخدام مقياس الجهد أثناء تدوير قرص الجهد لزيادته. بعد ذلك، اضبط الجهد بما يتناسب مع متطلبات التجربة.

بعد ذلك، ابدأ بتسجيل التصوير الزمني (time-lapse). قم بتغيير الوسط وإعادة ضبط الجهد الكهربائي حسب الحاجة. يمكن إضافة أوساط غذائية طازجة أو عقاقير أو عوامل كيميائية إلى الخزانات كل ساعة حسب المتطلبات.

باستخدام فتحات إضافية محفورة في غطاء طبق الزرع، بحيث تقع كل فتحة فوق خزان وسط غذائي. في هذه الخطوة، يتم تشريح الحبال الشوكية القطنية لفئران تبلغ من العمر أسبوعين. ثم يتم تقطيع الحبال الشوكية إلى مقاطع بسمك 500 micron باستخدام قطاعة أنسجة machel wane تحت مجهر تشريحي.

افصل الشرائح واختر تلك التي تتميز ببنية نخاع شوكي سهمية محورية سليمة. بعد ذلك، ضع الشرائح في طبق بتري بقطر 100 ملم يحتوي على 30 µL من هلام MA. ضعها في أقرب نقطة ممكنة من المركز.

يتم الحفاظ عليها في حضانة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. ومن أجل التجميع الذاتي لبروتينات matri gel، لإنتاج غشاء رقيق يغطي سطح شرائح النخاع الشوكي، من المهم جداً أن يكون matri gel قد تم تجميعه بالكامل. يتم تحضين طبق بتري عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إذا لزم الأمر، ثم يضاف من 4 إلى 6 ملليلتر من وسط D-M-E-M-F 12 المحتوي على 25 millimolar من محلول heis المنظم، و15 إلى 20% من مصل العجل الجنيني.

بلطف شديد لتجنب تدفق الوسط مباشرة على الشرائح، تأكد من أن الشرائح ليست مغمورة بالكامل في الوسط، مع ترك سطح الباذنجان معرضاً للهواء بشكل جيد. قم بتغيير الوسط مرتين أسبوعياً. الآن، قم بتحضين معلق الخلايا السلفية العصبية في الوسط مع 5 µM من hooks.

3، 3، 3، 4، 2 لمدة 30 دقيقة. تحت المجهر، استخدم أنبوباً زجاجياً شعرياً لحقن ميكروي بمقدار 2 µL من المعلق داخل شريحة النخاع الشوكي. تأكد ببطء من مرور الأنبوب الزجاجي الشعري عبر الـ matrigel وصولاً إلى الأجزاء الداخلية من شريحة النخاع الشوكي.

اترك الأنبوب الزجاجي داخل شريحة النخاع الشوكي لمدة 30 ثانية على الأقل لتجنب تعليق الخلايا. بعد ذلك، ضع طبق بتري الذي يحتوي على شريحة النخاع الشوكي في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي، قم ببناء غرفة توجيه كهربائي حول شريحة النخاع الشوكي تحتوي على خطافات 3 3 3 4 2 مُصنفة كخلايا تكوين عصبي قبل تطبيق مجال كهربائي بقيمة 500 millivolts لكل millimeter.

تُظهر الخلايا العصبية السلفية هنا هجرة موجهة للغاية نحو القطب السالب عند تعريضها للمجالات الكهربائية، حيث تمثل الخطوط الحمراء والأسهم الزرقاء مسارات واتجاه حركة الخلايا على التوالي. وهنا يظهر المخطط البياني لمسارات الهجرة الموضحة. وهنا تظهر الخلايا العصبية السلفية المحددة بالعلامات hooks 3 3, 3, 4 2.

تمت زراعتها في شريحة النخاع الشوكي النمطية العضوية عند بداية العلاج بالمجال الكهربائي. وبعد أن هاجرت الخلايا العصبية السلفية بشكل توجيهي نحو الكاثود لمدة 2.5 hours، تم عكس قطبية المجال الكهربائي. وقد أدى تغيير قطبية المجال الكهربائي إلى عكس حاد في اتجاه المحاور العصبية نحو الكاثود الجديد.

تظهر هنا صورة للخلايا العصبية السلفية المزروعة داخل شريحة من النخاع الشوكي. وفي نهاية التسجيل الزمني، يظهر هنا إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا العصبية السلفية المزروعة داخل شريحة النخاع الشوكي. تم إتقان الكتلة.

يمكن إنجاز هذه التقنية في غضون أسبوعين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح بعد تطويرها. وتمهد هذه التقنية الطريق الآن للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف هجرة الخلايا السلفية العصبية في أنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) استجابةً للمجال الكهربائي وتطبيقاً له.