توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الاستجابات الضوئية ومورفولوجيا العصبونات المفردة في الشبكية السليمة، وذلك باستخدام سلالة من الفئران تعبر عن علامة فلورية حصرياً في أنواع خلوية محددة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح العين للحصول على شبكية معزولة. وتتمثل الخطوة الثانية في وضع الشبكية تحت مجهر المسح الليزري وتصوير الخلية باستخدام استثارة الأشعة تحت الحمراء ثنائية الفوتون.

تُستخدم بعد ذلك ماصة دقيقة (micro pipette) للحصول على تكوين تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp configuration) بغرض التسجيل وملء الصبغة. وفي النهاية، يتيح هذا التحضير تسجيل الاستجابات الخلوية للتحفيز الضوئي ويكشف عن مورفولوجيا الخلية المسجلة بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy). وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الموجودة، مثل تسجيل تثبيت الرقعة غير الموجه من الشبكية، في إمكانية توجيه التسجيل بصرياً نحو خلية موسومة فلورسنتياً دون تحفيز الشبكية بضوء الإثارة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في أبحاث الشبكية، مثل: ما هي مساهمة مجموعة خلوية معينة في معالجة المعلومات البصرية؟ حتى لو كانت تلك المجموعة الخلوية ذات كثافة منخفضة ولا تحمل أي سمات مورفولوجية مميزة قد تسهل عملية تحديدها. ابدأ هذه التجربة بتكييف الفأر في الظلام لمدة ثلاث ساعات على الأقل قبل بدء التجربة.

في هذه الأثناء، قم بتحضير المحلول خارج الخلوي كما هو موضح في المخطوطة المرفقة وقم بفقاعته بكربوجين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتضحية الفأر واستخرج النويات من العينين باستخدام مقص قزحية منحني. ثم انقلها إلى طبق يحتوي على المحلول خارج الخلوي.

بعد ذلك، ضعها تحت مجهر تشريحي باستخدام مقص زنبركي. قم بإزالة القرنية والجسم الهدبي عن طريق فتح مقلة العين على طول الحافة المسننة. استخرج العدسة وافصل الشبكية بعناية عن الظهارة الصباغية.

بعد ذلك، اقطع العصب البصري بين الشبكية والظهارة الصباغية. قم بإزالة الشبكية من كأس العين. لاحظ أن الجزء الداخلي من الشبكية الملتفة هو جانب الخلايا العقدية.

يكون الجانب الخارجي هو جانب المستقبلات الضوئية. بعد ذلك، قم بإزالة الجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلي عن طريق سحبه برفق بمساعدة عود أسنان خشبي. ثم قم بإجراء شقوق قصيرة على طول محيط الشبكية لتسهيل تسطيح النسيج.

بعد ذلك، انقل الشبكية إلى غرفة التسجيل بحيث يكون جانب المستقبلات الضوئية متجهاً للأسفل. قم ببسطها على القاعدة الزجاجية باستخدام فرشاة دقيقة وثبتها بواسطة إطار من الفولاذ المقاوم للصدأ مثبت بخيوط النايلون. ضع غرفة التسجيل في الظلام تحت مجهر مسح ليزري رأسي.

قم بإجراء تروية فائقة للمستحضر الشبكي باستمرار بمعدل لا يقل عن 5 mL في الدقيقة. وباستخدام محلول خارج خلوي مؤكسج ومسخن إلى 35 °C، يتم وضع المجهر على طاولة هوائية ممتصة للصدمات داخل قفص فاراداي. ولضمان الحجب الإلكتروني، غطِّ القفص بستارة غير شفافة للحفاظ على المستحضر في الظلام.

كما نقوم بحجب الضوء المنبعث من شاشات الكمبيوتر باستخدام رقائق حمراء شفافة. يتم ضبط الليزر بالأشعة تحت الحمراء على طول موجي يتراوح بين 850 إلى 870 نانومتر أو أطوال موجية أطول. ثم يتم التحويل إلى وضع القفل النمطي واستخدام استثارة الفوتونين لتصور الخلايا التي تعبر عن GFP.

من أجل تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp)، املأ الماصات الزجاجية الدقيقة المصنوعة من بوروسيليكات الزجاج بالمحلول داخل الخلوي الذي يحتوي على مسبار فلوري كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. ثم أدخل الماصة الدقيقة في الحامل. تأكد من أن القطب المرجعي في حالة تلامس مع المحلول خارج الخلوي في غرفة التسجيل.

بعد ذلك، قم بتطبيق الضغط بواسطة الماصة الدقيقة على الخلية المستهدفة التي تعبّر عن A GFP باستخدام عدسة شيئية غمر مائي بقوة تكبير 40 ضعفاً. تقع أجسام خلايا Omicron في طبقة الخلايا العقدية وكذلك في الجزء القريب من الطبقة البينية قبل أن تتصل الماصة الدقيقة بالخلية المستهدفة، حيث يتم اختراق الغشاء المحدِّد الداخلي عند سطح الشبكية. ويُستدل على نجاح الاختراق من خلال خروج المحلول داخل الخلوي من طرف الماصة الدقيقة وانفصال الغشاء المحدِّد الداخلي عن أنسجة الشبكية الكامنة تحته. ويمكن للصبغة الفلورية الموجودة في المحلول داخل الخلوي أن تكشف عن موقع الماصة الدقيقة في صورة الفوتونين أثناء الاقتراب من الخلية المطلوبة.

ثم قم بتحرير الضغط من الماصة الدقيقة (micro pipette) للحصول على تكوين تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp). وفي وضع تثبيت التيار (current clamp mode)، يجب أن يعطي التسجيل الصالح جهد غشاء يتراوح من 50- إلى 55- millivolts ويستمر لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، قم بتقديم المحفزات البصرية التي تم إنشاؤها على شاشة الكمبيوتر.

قم بضبط شدة التحفيز عن طريق إدراج مرشحات الكثافة المحايدة في مسار الشعاع، واضبط الموضع المكاني للتحفيز ليكون في مركز الخلية المسجلة. بعد ذلك، ابدأ بروتوكول التحفيز وسجل الاستجابات الضوئية. استخدم مولد التحفيز لتفعيل برنامج التسجيل.

أضف صماماً ثنائياً ضوئياً (photo diode) ضمن مسار الحزمة لتسجيل توقيت التحفيز. كن حذراً من سحب جسم الخلية عند تراجع الماصة الدقيقة. وعند الانتهاء من ملء الصبغة، اترك العامل الفلوري ينتشر داخل الخلية المسجلة لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة.

فيما يلي مثال للخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في تحضير مسطح للشبكية تحت مُحفزها. بالنسبة لإنزيم تيروسين هيدروكسيلاز، يمكن تمييز مجموعتين من الخلايا من خلال شدة إشارة الـ GFP. تظهر الخلايا الدوبامينية من النوع الأول الموجودة في الطبقة بين النووية فلورة ضعيفة كما تشير رؤوس الأسهم في الشكل A. أما خلايا النوع الثاني فقد كانت موسومة بكثافة ولها أجسام خلوية إما في الطبقة نفسها كما تشير الأسهم في الشكل A، أو مزاحة في طبقة الخلايا العقدية كما يظهر في الشكل B. ويوضح الشكل C التطبق الشجيري لخلايا النوع الثاني في الطبقة الثالثة من الطبقة الضفيرية الداخلية، بينما يظهر هنا مثال لمورفولوجيا خلية من النوع الثاني حُقنت بالمقتفي نيوروبيوتين (neuro biotin).

تم تصور المقتفي لاحقاً عن طريق الربط بستريبتاديفين مُسمى فلوروسنتياً، والذي يظهر هنا باللون الأرجواني. تظهر هنا أنماط استجابة مختلفة لخلية من النوع الثاني تقع في طبقة الخلايا العقدية تجاه الضوء الأبيض. استُخدم تحفيز مطول لمدة ثلاث ثوانٍ لتحقيق تمييز أفضل لمكونات الاستجابة عند بداية التحفيز وعند انتهائه، وذلك اتباعاً لهذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل التجارب الدوائية، أو تصوير الكالسيوم، أو الكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على أسئلة إضافية مثل الدور الوظيفي لنوع معين من الخلايا في دوائر الشبكية.