كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التصوير المباشر لنقص الأكسجة النسيجي في المناطق الدقيقة داخل قشرة الدماغ للفأر في الجسم الحي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إعداد نافذة قحفية مفتوحة في فأر مخدر، ثم حقن صبغة فلورية وريدياً لوسم الأوعية الدموية الدماغية.

وأخيراً، يتم إجراء تصوير فوتوني متزامن لفلورة NADH الذاتية والأوعية الدموية الدقيقة القشرية الموصومة فلورياً. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر نقص الأكسجة الوظيفي في مناطق دقيقة من متن الدماغ من خلال تصور وجود الشكل المختزل من nicotinamide, adenine dinucleotide. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل أقطاب Clark في أنها توفر دقة مكانية عالية عبر مجال رؤية واسع، كما أنها أقل بضعاً.

يمكن إجراء هذه الطريقة باستخدام نظام تصوير فوتوني تطبيقي قياسي يحتوي على قناتين فلوريسنتيتين. مرحباً، أنا ستيف هيرست، أستاذ ورئيس قسم الميكروبيولوجيا والمناعة في جامعة روتشستر، وسيقوم بتوضيح الإجراء اليوم أنيتا صن من مختبر كيشكا، بالإضافة إلى أوكسانا بولكا، الأستاذ المساعد في الأبحاث من مختبرنا. لا يمكن للدكتور كيشكا، الذي ابتكر تقنية تصوير NADH، التواجد هنا اليوم بسبب انتقاله مؤخراً إلى ألمانيا. بعد تحضير الموقع الجراحي باستخدام الأدوات اللازمة التي تم تعقيمها بجهاز الأوتوكلاف أو تطهيرها بـ 70% ethanol وتخدير الفأر بـ 5% isof fluorine، يوضع الفأر على وسادة تدفئة ويتم وضع قناع وجه لإعطائه 1.3 إلى 1.5% isof fluorine في الهواء.

تحقق من مستوى التخدير عن طريق قرص الذيل. بعد ذلك، أدخل مسباراً شرجياً وقم بقياس درجة حرارة جسم الحيوان باستمرار طوال فترة الإجراء. ضع هلام الدموع الاصطناعية في عيني الفأر لمنع جفافهما.

بعد ذلك، يتم إزالة الشعر من الرأس وكلا الفخذين، حيث يوضع مزيل الشعر على الفخذ لمدة دقيقتين لإزالة الشعر المتبقي، وسيتم استخدام الفخذ لقياس تأكسج الدم. وأخيراً، يتم تطهير فروة الرأس باستخدام محلول بوفيدون أيودين 10% وإيثانول 70%. ولعمل نافذة جمجمية، يبدأ القص بالمقص على بعد خمسة مليمترات من الجمجمة.

قم بإجراء شق في فروة الرأس وتقدم مسافة 1 cm. حرّك الجلد إلى الجانبين للكشف عن الجمجمة لإزالة الأغشية الموجودة فوقها. ضع محلول ferric chloride بتركيز 10%.

امسح المحلول الزائد واكشط الأغشية بزاوية 45 درجة. رقم خمسة، ملقط باستخدام مجهر تشريحي، حدد المنطقة المراد دراستها. ضع طبقة رقيقة من الغراء سريع الجفاف حول حواف نافذة الصفيحة الرأسية.

قم بوضع لوحة الرأس بحيث تكون المنطقة المستهدفة مكشوفة في النافذة، ثم اضغط ضغطاً خفيفاً على لوحة الرأس. ضع كمية صغيرة من الإسمنت السني لبلمرة الغراء بسرعة. استمر في التثبيت لمدة 10 seconds بينما يتصلب الغراء بالبلمرة.

ضع كمية صغيرة من الغراء سريع الجفاف على حواف النافذة لإحكام غلق الصفيحة الرأسية والجمجمة. بعد ذلك، قم بتثبيت الصفيحة الرأسية في حامل الحيوان باستخدام البراغي تحت مجهر التشريح. استخدم مجموعة مثقاب العزم الدقيق (micro torque two) المضبوطة على 6,000 RPM ولقمة مثقاب IRF 0 0 5.

قم بإزالة كل الغراء الزائد من الجمجمة ومن لوحة التثبيت. بعد ذلك، اضبط المثقاب على 1000 RPM وابدأ في ثقب الجمجمة عن طريق رسم دائرة داخل نافذة لوحة التثبيت بقطر يبلغ حوالي 5 mm. استخدم حركات مسح خفيفة كما لو كنت ترسم بقلم رصاص ناعم للغاية.

توقف عن الحفر كل 20 إلى 30 ثانية واستخدم الهواء المضغوط لإزالة غبار العظام. ومع استمرار الحفر، يتشكل تجويف حول الجمجمة السليمة في المركز. احذر من ثقب الجمجمة الرقيقة، وتأكد من أن هذا التجويف ذو سمك متساوٍ.

بالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر الشديد حول الأوعية الدموية الكبيرة، إذ يجب عدم الإضرار بها، وتجنب لمسها قدر الإمكان. وباستخدام طرف واحد من الملقط، ارفع العظم الموجود في مركز النافذة، ثم ضع قطرة من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي على النافذة. وباستخدام زاوية من منديل Kim wipe، امسح السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي برفق بزاوية 45 درجة.

رقم خمسة، الملاقط. حدد منطقة تالفة من الأم الجافية على طول حافة النافذة وارفعها لإزالتها. في حال حدوث نزيف، ضع قطرة من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي وانتظر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتوقف النزيف الطفيف.

بعد ذلك، قم بتحضير 10 milliliters من 0.07% low melting agar المذاب في سائل نخاعي اصطناعي. ارفع درجة حرارة الـ agar المذاب إلى درجة حرارة الجسم. امسح السائل النخاعي الاصطناعي الزائد من على سطح الدماغ.

صب مادة الـ aeros في النافذة وغطّها بشريحة زجاجية. ثم اضغط على الزجاج برفق لإحداث تلامس بين الزجاج والصفيحة الرأسية، وانتظر لمدة تتراوح بين 10 إلى 20 ثانية حتى تتصلب مادة الـ aero. باستخدام ملاقط وورق مناديل ناعم، قم بإزالة الـ aero الزائد من الغطاء الزجاجي.

ضع كمية صغيرة من الغراء سريع المفعول حول الزجاج للصقه باللوحة الرأسية. ثم ضع كمية صغيرة من الأسمنت السني لتدعيم الغراء من أجل الحقن في الوريد الفخذي. أدر الحيوان جزئياً للكشف عن الجانب الداخلي للفخذ الأيسر.

استخدم شريطاً لاصقاً لتثبيت الحيوان. وفي هذه الوضعية، ضع غسولاً مطهراً، ثم ضع إيثانول بتركيز 100% على الجلد. بعد ذلك، قم بإجراء شق على طول الفخذ الإنسي من الركبة وصولاً إلى الارتفاق العاني.

إذا لزم الأمر، افصل الأنسجة الرخوة عن طريق التشريح غير الحاد. املأ حقنة سعة 1 مل بـ 130 µL من صبغة Texas red. قم بتركيب إبرة جديدة عيار 30 وقم بثنيها بعناية بزاوية 30 درجة، مع إبقاء الشطبة متجهة للأعلى.

املأ الإبرة بمحلول Texas Red تحت مجهر تشريحي، ثم أدخل الإبرة في الوريد الفخذي واحقن 100 µL من Texas red. اسحب الإبرة واضغط برفق على الوريد باستخدام شاش لوقف النزيف. أغلق الجلد باستخدام خيط جراحي 4-0 لمراقبة تشبع الأكسجين في الدم بشكل مستمر.

ضع مسبار مقياس التأكسج على الفخذ الأيمن الذي تمت إزالة الشعر منه مسبقاً. لبدء التصوير، انقل الفأر المجهز جراحياً إلى منصة المجهر. التقط صورة أولية لموقع النافذة القحفية باستخدام إضاءة الحقل المضيء (Bright Field) بتكبير 4x لاستخدامها كخريطة مرجعية للمطابقة مع تكبيرات أعلى لتصوير الفوتونات.

قم بتكبير منطقة الاهتمام باستخدام تكبير 10x. حدد منطقة اهتمام في الطبقات القشرية. اضغط على الرقم واحد أو اثنين لبدء تسجيل السلسلة الزمنية.

نوصي باستخدام متوسط يتراوح من ثلاثة إلى خمسة إطارات لزيادة جودة الصورة. بعد ذلك، قم بتحفيز نقص تأكسج الدم عن طريق إضافة 50% nitrogen إلى الهواء الذي يتنفسه الحيوان. سيؤدي ذلك إلى خفض مستوى الأكسجين إلى 10% وتحقق من نقص تأكسج الدم من خلال مراقبة بيانات مقياس التأكسج.

استمر في تسجيل السلسلة الزمنية خلال فترة نقص تأكسج الدم لمدة 30 ثانية تقريباً وبعد استعادة مستوى الأكسجين الطبيعي. قم بجمع البيانات لحساب توزيع الأكسجين من خلال رصد وقياس وتحديد مساحة أسطوانات الأنسجة التي تعاني من نقص الأكسجة والأنسجة المؤكسجة المحيطة بالأوعية الدموية. ولتحديد نصف قطر أسطوانة الأنسجة R، قم بقياس المسافة بين مركز الوعاء الدموي والحد الذي يتم عنده رصد فلورة NADH العالية.

يُرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب للاطلاع على طرق معالجة البيانات. يوضح هذا الشكل صوراً متزامنة لـ NADH والجغرافيا من فيديو تم تسجيله أثناء نقص الأكسجة العابر، حيث خُفض تركيز الأكسجين المستنشق من 21% إلى 10% لمدة ثلاث دقائق. ويُعد هذا المستوى من نقص الأكسجة المستحث تجريبياً كافياً لإحداث نقص أكسجة شديد في القشرة المخية.

أدى نقص الأكسجة إلى زيادة في تألق NADH الموضح باللون الأخضر في البداية في المناطق الأبعد عن التروية الدموية الشريانية. لاحظ حدود أنسجة NADH الحادة، والتي تمثل حدود انتشار الأكسجين المرصودة من الدورة الدموية الدقيقة القشرية الموضحة باللون الأحمر. تظهر هنا صورة متزامنة للأوعية الدقيقة الموصومة فلورياً في القشرة باللون الأحمر، وتألق NADH الذاتي من المادة الرمادية في القشرة باللون الأخضر، حيث يكون توزيع كثافة تألق NADH ثنائياً.

توجد مناطق ذات فلورية NADH منخفضة بشكل موحد ومناطق ذات فلورية NADH مرتفعة بشكل موحد. وتمثل الخطوط الصفراء حدود الأنسجة بين المناطق ذات فلورية NADH المنخفضة والمرتفعة. وتظهر حدود الأنسجة هذه علاقة مكانية مع الأوعية الدموية الدقيقة المجاورة.

يتم تحديد هذه العلاقة عن طريق انتشار الأكسجين من الأوعية الدموية الدقيقة إلى الأنسجة. وفي بعض الحالات، يمكن تمييز الطبيعة الأسطوانية أو أسطوانة نسيج CRO لهذه الحدود النسيجية بشكل مباشر كما هو موضح بالخطوط الزرقاء. وهنا، تكون الحدود النسيجية ذات شكل دائري مع وجود وعاء دموي مركزي متراكز بمجرد إتقان العملية.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 1.5 hours إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر لصق غطاء الزجاج بالصفيحة المعدنية لمنع الحركة الرأسية لسطح القشرة الناتجة عن الوذمة. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليلات إضافية مثل قياسات فرط الدم الوظيفي بهدف معالجة أسئلة إضافية مثل العلاقة بين نقص أكسجة الأنسجة والاقتران الوعائي الدماغي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور نقص الأكسجة النسيجية الإقليمية الدقيقة في قشرة الدماغ للفأر.