الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التغيرات في الشبكات الشعرية القشرية بعد التعرض المطول للسموم الفيروسية لفيروس العوز المناعي البشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فحص التغييرات الرئيسية في مورفولوجيا الشعيرات الدموية القشرية التي قد تساهم في التسبب في الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي الدقيق من الناحية الفسيولوجية للمعلمات المورفولوجية الشعرية المتعددة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتسبب في الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. يمكن تطبيقه أيضا على الأمراض الأخرى التي تحدث فيها تغيرات في الأوعية الدموية مثل مرض الزهايمر. ابدأ هذا الإجراء بوضع جل دموع اصطناعي على عيون فأر مخدر.

بعد ذلك ، احلق رأسه باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ثم ضع محلول اليود بوفيدون لتعقيم فروة الرأس واتركها تجف. تحت المجهر الضوئي ، قم بإزالة فروة رأس ، لفضح العظام الجدارية والعظام الأمامية الذيلية ونقطة بريجما تماما.

ضع كمية صغيرة من محلول كلوريد الحديديك بنسبة عشرة بالمائة على الجمجمة ، لتجفيف الغشاء لسهولة إزالته. بعد ذلك ، قم بإزالة الغشاء المجفف ، عن طريق كشط الجمجمة برفق باستخدام الملقط. ثم ضع طبقة رقيقة من الغراء حول نافذة لوحة الرأس.

اضغط برفق على لوحة الرأس على جمجمة الماوس ، للحفاظ على منطقة الاهتمام في وسط النافذة. بعد ذلك ، ضع قطرة من الأسمنت السني على لوحة الرأس لبلمرة الغراء. بعد ذلك ، ضع طبقة رقيقة من الغراء على طول حافة نافذة لوحة الرأس لإنشاء خزان لتثبيت المحلول الملحي.

بمجرد أن يجف الغراء ، قم بربط لوحة الرأس في حزام لوحة رأس الماوس. قم بإزالة أي غراء من نافذة لوحة الرأس باستخدام مثقاب متصل بمثقاب التورب الصغير ، على 6 ، 000 دورة في الدقيقة. توقف كل 10 إلى 15 ثانية لمنع ارتفاع درجة حرارة جمجمة الماوس.

بعد ذلك ، باستخدام مثقاب جديد ، ابدأ في ترقق الجمجمة باستخدام مثقاب التورب الصغير عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة. حرك المثقاب برفق عبر الجمجمة دون ضغط مباشر لأسفل. بمجرد ترقق الجمجمة تماما ، افصل الماوس عن الحامل وضعه على ظهره.

قم بلصق كلا الطرفين الخلفيين برفق لكشف الفخذين الإنسي بوضوح. ثم قم بإزالة الشعر فوق كلا الفخذين الإنسي وتطهير موقع الجراحة عن طريق تغطية الفخذين باليود البوفيدون. بعد ذلك ، قم بإزالة الجلد برفق على الفخذ الأيمن الإنسي ، فوق الوريد الفخذي والشريان.

ضع ما يقرب من ثلاث إلى خمس قطرات من محلول ملحي 0.9٪ على موقع الجراحة. بعد ذلك ، افصل الوريد الفخذي عن الشريان ، عن طريق تشريح صريح إلى حزمة الأوعية الدموية العصبية الفخذية. الآن ، ضع قطعتين من الخيط الجراحي بطول ثلاثة سنتيمترات ، أسفل الشريان الفخذي ، على بعد سنتيمتر واحد تقريبا.

قم بلف الخيط العلوي في اتجاه عقارب الساعة لإنشاء عاصبة وعائية تساعد على منع فقدان الدم المفرط أثناء القسطرة. بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير في الشريان الفخذي باستخدام مقص زنبركي ، حيث سيتم إدخال القسطرة لاحقا لمراقبة المعلمات الفسيولوجية للفأر. في هذا الإجراء ، قم بإزالة الجلد الموجود على الفخذ الأيسر الإنسي للفأر.

بعد ذلك ، حدد موقع الوريد الفخذي. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد وإبرة قياس 30 ، ارسم 130 ميكرولترا من محلول صبغة الفلورسنت. حقن 100 ميكرولتر من الصبغة ببطء في الوريد الفخذي.

بعد إزالة الإبرة ، ضع ضغطا لطيفا ثابتا على موقع الحقن لوقف أي نزيف والسماح للصبغة بالدوران لمدة خمس دقائق. ثم أغلق موقع الجراحة بالغرز. اقلب الماوس بحذر على بطنه وضعه في حزام لوحة رأس الماوس.

بالنسبة لتصوير الفوتون في الجسم الحي ، انقل الجهاز الجراحي إلى مجهر الفوتون وتأكد من الحفاظ على مستوى تخدير. بعد ذلك ، ضع كمية صغيرة من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في خزان لوحة الرأس وهدف المجهر السفلي بحيث يتلامس مع المحلول الملحي. بعد ذلك، حدد موقع منطقة الاهتمام باستخدام هدف عرض المجال الساطع.

بعد ذلك ، ابدأ تصوير الفوتونين. حدد موقع سرير شعري على شاشة العرض وقم بتكبير هذه المنطقة باستخدام التكبير/التصغير البصري أيضا. احصل على صور للشعيرات الدموية باستخدام برنامجي تصوير الفوتون.

لتصوير الفوتون خارج الجسم الحي ، قم بعمل شق في فروة الرأس من العظام الجدارية إلى العظام الأمامية للفأر المقطوع الرأس. قم بتثبيت الجلد على جانبي الجمجمة بإصبع السبابة والإبهام ، ضع المقص الدقيق للغاية أسفل العظم الجداري الإنسي وقم بقص الجمجمة على طول الخيط السهمي حتى حوالي ثلاثة ملليمترات بعد نقطة بريجما. بعد ذلك ، افصل الجمجمة عن الدماغ وقم بإزالة أي سحايا بعناية من سطح الدماغ باستخدام الملقط.

حرك الملقط برفق تحت الدماغ لتحريره من الجمجمة. بعد ذلك ، ضع الدماغ في مصفوفة دماغية خاصة بالفئران واغسله بقطرات من ACSF. بعد ذلك ، قم بإزالة قسم الدماغ الإكليلي بسمك ملليمتر.

ضع قسم الدماغ على شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على ACSF ، بحيث يكون الجزء الأمامي من القسم متجها لأعلى. ثم قم بتغطية شريحة الدماغ برفق بقلة غطاء زجاجي. انقل الشريحة إلى مرحلة المجهر وضع كمية صغيرة من 0.9٪ محلول ملحي على زلة الغطاء.

اخفض هدف المجهر حتى يتلامس مع المحلول الملحي. بعد ذلك ، حدد موقع خط الوسط للدماغ باستخدام هدف المجال الساطع. الآن ، ابدأ تصوير الفوتون ، وحدد موقع خط الوسط مرة أخرى باستخدام هدف 25x.

أنجز ذلك من خلال البحث عن الشق الطولي على السطح القشري للقسم الإكليلي. بعد ذلك ، ضع الحافة اليمنى لشاشة التصوير على خط المنتصف وحرك شاشة العارض بشكل جانبي على ثلاثة إطارات كاملة. حدد العمق الذي تكون فيه الشعيرات الدموية بالكاد مرئية على شاشة العرض.

بعد ذلك ، قم بخفض مستوى التركيز البؤري لمدة 20 ميكرومتر إضافي لتحديد الجزء العلوي من z-stack. اضبط سمك الصورة على ميكرومتر واحد. قم بخفض شاشة العرض لمدة 100 ميكرومتر واضبط طاقة الليزر في جميع أنحاء بحيث يكون أقل من واحد بالمائة من وحدات البكسل مشبعة بشكل مفرط.

أخيرا ، احصل على z-stack. في هذا الشكل ، بعد تحضير شريحة الدماغ ، توجد منطقة تصوير على بعد حوالي 1.5 ملم من خط الوسط. ينتج مكدس z 100 ميكرومتر صورة ثلاثية الأبعاد تستخدم للتحليل في برنامج أميرة التحليلي.

ثم يتم تتبع الشبكة الشعرية يدويا عن طريق وضع العقد في بداية ونهاية الشعيرات الدموية أو أي مكان تتفرع فيه الشعيرات الدموية إلى أخرى. ينتج عن هذا صورة هيكلية بالكامل يتم استخراج المعلمات المورفولوجية منها تلقائيا. يمكن استخراج عدد العقد الشعرية والأجزاء ومتوسط طول المقطع وطول المقطع الكلي باستخدام تصويرين من الفوتون خارج الجسم الحي لشرائح دماغ الفأر.

هنا ، يتم إنتاج صورة ثنائية الأبعاد للشبكات الشعرية عن طريق التصوير في الجسم الحي ، حيث يمكن استخراج القطر الشعري ويمكن حساب الحجم الكلي للشعرية باستخدام القطر الشعري وطول المقطع الكلي الذي تم الحصول عليه من التصوير خارج الجسم الحي. بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال هذا الإجراء في غضون ثلاث ساعات ونصف إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء إجراء هذا الإجراء ، من المهم التحرك بسرعة مع الحفاظ على مستوى ثابت من التخدير لأن الأيزوفلوران يمكن أن يتسبب في توسع الأوعية الدموية في الشعيرات الدموية القشرية ، وبالتالي تحريف البيانات.

خلال هذا الإجراء ، يمكن الحصول على معلمات شعرية أخرى ، مثل سرعة خلايا الدم الحمراء أو تدفق خلايا الدم الحمراء ، والتي يمكن أن توفر فهما أعمق للتغيرات المسببة للأمراض التي تظهر في الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية والأمراض التنكسية العصبية الأخرى. حظا سعيدا في تجاربك.