تصور كا الأوعية الدموية ^{2 +} اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير إشارات الكالسيوم الوعائية التي تحفزها أنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الخلايا المجاورة أو r os. ويتم تحقيق ذلك من خلال تصوير R os أولاً باستخدام صبغات حساسة للأكسدة في البلاعم النشطة. كما يمكن تصوير ROS في الخلايا البطانية باستخدام مستشعرات فلورية قائمة على البلازميد.

بعد ذلك، انتقل إلى التصوير المتزامن للخلايا البلعمية المنشطة المميّزة بـ cell tracker red والخلايا البطانية المميّزة بـ flu of four في نموذج زراعة مشتركة. وأخيراً، قم بقياس إشارات الكالسيوم في الخلايا البطانية الناتجة عن الـ R os المشتقة من الخلايا البلعمية، وذلك باستخدام نظام تصوير بؤري.

يمكن لهذه النتائج أن توضح مستويات ROS بشكل مستقل، بالإضافة إلى التقييم المتزامن لتحريك الكالسيوم داخل الخلايا الذي تحفزه ROS المشتقة من Peregrine. تتيح هذه الطريقة التقييم المتزامن لجزيئين مختلفين من جزيئات الإشارة التي تثير بشكل وثيق إشارات وعائية وإعداداً فسيولوجياً مرضياً محاكياً. سيقوم باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه في مختبري، Karthik وRaj، بشرح الإجراء الخاص بقياسات ROS والكالسيوم والتفاعلات بين الخلايا البلعمية والخلايا البطانية.

قم باستنبات البلاعم المشتقة من الوحيدات في الفئران على أطباق ذات قاع زجاجي بقطر 35 مليمتر. ثم قم بتحفيز الخلايا باستخدام ناهضات المستقبلات الشبيهة بالتول، واحضنها لمدة ست ساعات عند درجة حرارة 37 °C. وذلك لتصوير السيتوسول.

للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، أضف صبغة حساسة للأكسدة واحضن الخلايا لمدة 20 دقيقة. الآن، قم بتصوير الخلايا باستخدام منصة يتم التحكم في درجة حرارتها في نظام تصوير بؤري (confocal imaging system). بدلاً من ذلك، لتصوير ROS الميتوكوندرية في الخلايا المنشطة بواسطة TLR، أضف مؤشر السوبر أكسيد الميتوكوندري واحضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

لإجراء ضابط سلبي، تُعالج الخلايا إما بمحلول PBS أو DMSO. ولإجراء ضابط إيجابي، تُعالج الخلايا بـ 2 mM من antimycin. بعد ذلك، يتم الانتقال لتصوير جميع الخلايا على منصة التحكم في درجة الحرارة الخاصة بنظام التصوير البؤري (confocal imaging system).

باستخدام برنامج Image J، قم بتحليل جميع بيانات الصور. يستشعر المستشعر الفلوري hyper بشكل فائق التركيزات دون الميكرومولارية من البيروكسيد، وبناءً على التعبير الثديي، يمكن توجيه تصميم الناقل إما إلى السيتوبلازم أو الميتوكوندريا. باستخدام التثقيب الكهربائي، قم بإنشاء خطوط مستقرة من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية للفئران التي تحمل بلازميد التعبير المفرط hyper المناسب.

لتسهيل نمو المستعمرات، يتم زرع الخلايا بكثافة منخفضة في وسط TMEM كامل وتحضينها لمدة 48 ساعة، ثم يُستبدل الوسط بوسط زراعة كامل مضاف إليه مضاد حيوي انتقائي. يتم فحص المستعمرات لتحديد أعلى نسبة من الخلايا فائقة الإيجابية وتكثير المزرعة لإنشاء خطوط مستقرة فائقة الإيجابية لاستخدامها في تجارب فردية. تُزرع الخلايا على شرائح غطاء زجاجي مطلية بـ 0.2% gelatin وتُزرع طوال الليل حتى تصل إلى 80% confluence.

قم الآن بتنشيط الخلايا باستخدام ربيطات TLR واحضنها لمدة ست ساعات عند 37 درجة Celsius. ولكشف أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في السيتوبلازم، قم بتثبيت شرائح التغطية التي تحتوي على الخلايا في غرفة خلايا adelo. أضف 1 mL من محلول Hank's balanced salt solution المدفأ مسبقاً، وضع الغرفة على منصة التحكم في درجة الحرارة الخاصة بنظام التصوير confocal.

سجل تغيرات الفلورة في الخلايا للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الميتوكوندرية mitochondrial ROS. تضمن تجربة ضابطة موجبة باستخدام antimycin A بتركيز 2 µM. بعد ذلك، قم بتجهيز شرائح الغطاء الخاصة بالخلايا المعالجة للفحص بالمجهر البؤري. أجرِ تحليل الصور باستخدام برنامج Image J.

ابدأ باستخدام خلايا بطانية نمت حتى وصلت إلى 80% من التلاقي على شرائح غطاء زجاجية مطلية بالجيلاتين لتصوير وقياس تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا. قم بتحضين الخلايا في الصبغة الفلورية flu oh 4:00 AM في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ولتقليل فقدان الصبغة، اغسل الخلايا بمحلول التصوير التجريبي الذي يحتوي على suen pyro zone. الآن قم بتثبيت شرائح الغطاء على غرفة adelo cell باستخدام 800 µL من محلول التصوير التجريبي المسخن مسبقاً، وضع الخلايا على منصة بنظام تحكم في درجة الحرارة الخاصة بنظام التصوير البؤري (confocal) في أنبوب منفصل.

استخدم 500 nanograms per milliliter من صبغة cell tracker red C-M-T-P-X لمدة 15 minutes لوسم مجموعة الخلايا البلعمية قيد الدراسة، ثم اغسل الخلايا وأعد تعليق الرواسب في 200 microliters من محلول التصوير التجريبي. الآن، أضف الخلايا البلعمية الموُسّمة فوق الخلايا البطانية المحملة بـ flu oh 4:00 AM في مجموعة غرفة المجهر البؤري (confocal chamber assembly)، ثم سجل الفلورية الخضراء والحمراء كل three seconds لمدة 10 minutes.

في هذه التجربة، تم تحفيز خلايا J 7 74 0.1 باستخدام ربيطات TLR 2 و3 و4 لمدة ست ساعات. وتظهر الصور الممثلة بالمجهر البؤري زيادة في ROS السيتوبلازمي وفقاً لقياسات DCF. ومن المثير للاهتمام أن الفلورة الحمراء لـ MitoSOX تشير إلى زيادة مماثلة في ROS الميتوكوندري.

تعد هذه التغيرات في الفلورة كمية. وبناءً على ذلك، يجب تطبيع النتائج والتعبير عنها كـ تغير طي نسبي لكل معالجة، حيث تعمل إشارة antimycin a كضابط موجب لإنتاج ROS الميتوكوندري. يوضح هذا الشكل صوراً لمستويات البيروكسايد في الخلايا البطانية والسيتوبلازم والميتوكوندريا في حالات التعبير المستقر عن hyper cyto أو hyper D mito.

خلايا MP ECS المحفزة بمحفزات TLR. يوضح قياس التغير في متوسط الفلورة زيادة في فلورة hyper cyto و hyper D mito بعد ست ساعات من التحفيز في نظام الزراعة المشتركة. ولتقييم إشارات Peregrine ROS، تم تنشيط خلايا mirin macrophages المعزولة حديثاً من الفئران من النوع البري (wild type) والفئران المفتقرة لـ GP 91 Fox باستخدام 1 µg/mL من LPS لمدة ست ساعات.

تم وسم الخلايا البلعمية باللون الأحمر باستخدام C-M-T-P-X وإضافتها إلى خلايا MPM ecs المحملة بالفلورسنت الأخضر. ومن المثير للاهتمام أن الخلايا البلعمية المنشطة بواسطة LPS والمعزولة من الفئران من النوع البري (wild type) أدت إلى تعبئة كبيرة وسريعة للكالسيوم في خلايا MPM ECS مقارنة بالخلايا البلعمية المستخلصة من الفئران التي تفتقر إلى GP 91 Fox.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن إما التحميل المطول أو التعرض لليزر قد يؤدي إلى الأكسدة التلقائية لـ DCF. ومن الضروري تجنب التبييض الضوئي لـ hyper cyto و hyper D mitral. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء قياس RA في الخلايا البلعمية وكذلك في الخلايا البطانية في غضون سبع ساعات إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح.