النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

يهدف هذا النظام التجريبي إلى توصيف مساهمة بروتينات معينة في عملية الغزو. ابدأ بنقل البروتين الفلوري المطلوب إلى الخلايا عبر ترنسدكشن فيروسي قهقري. قم أيضاً بإنشاء مصفوفة ثلاثية الأبعاد من بروتين matrigel في أغشية transwell، وجهز معلقاً خلوياً بالتخفيف المناسب.

باستخدام نظام Matrigel transwell، قم بقياس استجابة الهجرة عبر الغشاء تجاه الجاذب الكيميائي مع استخدام الأدوية أو العلاجات المختبرة، ثم انتقل إلى تصوير وتحليل غزو الخلايا بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy). وفي النهاية، يمكن للنتائج تحديد مقدار ونمط غزو الخلايا داخل مصفوفة بروتينية ثلاثية الأبعاد. وتكمن قوة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل اختبار غزو Transwell التقليدي، في قدرتها على توفير بيانات كمية ونوعية حول غزو الخلايا لمصفوفة بروتينية ثلاثية الأبعاد.

ستقوم زميلتي، ديان كريغتون، الآن بتوضيح طريقة زراعة خلايا تغليف الفيروسات القهقرية في وسط DMEM المحتوي على 10% FBS لمدة 48 ساعة. قم بنقل الحمض النووي للفيروس القهقري إلى الخلايا وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يتم التحضين لمدة 24 ساعة، ثم تُشطف الآبار مرتين بالوسط، وبعد ذلك يُضاف 1.5 milliliters من 10% F-P-S-D-M-E-M لكل بئر، وتُحضن لمدة 48 ساعة لجمع الفيروس القهقري المغلف.

انقل وسط استزراع الأنسجة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 mL، ثم قم بإجراء الطرد المركزي لترسيب أي خلايا وجمع المادة الطافية في أنبوب نظيف. خزن هذا المخزون من الفيروس القهقري عند درجة حرارة -80 °C. ولإجراء عملية ترانسدكشن للخلايا بواسطة الفيروس القهقري، أزل الوسط من المزرعة التي استمرت طوال الليل وأضف 1 mL من مخزون الفيروس القهقري المضاف إليه poly green.

بعد تحضين لمدة ست ساعات، أضف 2 mL من 10%F-B-S-D-M-E-M إلى البيئة، ثم ضع الأطباق في حاضنة عند 37 °C. وخلال الليل، قم بتجديد الوسط الغذائي، وبعد 24 ساعة، أضف الوسط الانتقائي المناسب، وعندما تصبح الخلايا متلاحمة، قم بحصاد الخلايا وفرزها بناءً على الفلورية باستخدام خلايا غير منقولة كمرجع. اجمع الخلايا التي تظهر فلورية أعلى من الخلايا غير المنقولة، وقم بتجميد حصص منها عند -80 °C لاستخدامها مستقبلاً.

تعتمد هذه الطريقة على التعبير عن البروتينات الفلورية للتصور، وتسمح بتحديد مساهمات الخلايا الفردية. قم بإذابة Matrigel على الثلج، ثم خففه بنسبة واحد إلى واحد في PBS بارد جداً. الآن، ضع transwells غير المطلية في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً.

بعد ذلك، قم بنقل 100 µL من الماتريجيل (matri gel) المخفف بعناية باستخدام الماصة إلى الآبار واتركه يتصلب عند 37 °C. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير معلقات الخلايا الموصومة فلورياً في وسط نموها الطبيعي. وعندما يتصلب الماتريجيل، اقلب الترانزويلز (transwells) وقم بنقل 100 µL من معلق الخلايا بواسطة الماصة على الجانب السفلي للمرشح المواجه للمخرج.

غطِّ الآبار الغشائية (transwells) بعناية باستخدام قاعدة طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً، بحيث يتم ملامسة كل قطرة من معلق الخلايا. حضّن الطبق في وضع مقلوب لمدة أربع ساعات للسماح بالتصاق الخلايا. ثم اقلب الأطباق إلى وضعها الصحيح واغسل كل بئر غشائي عن طريق غمسه مرتين في 1 mL من الوسط الخالي من المصل.

بعد ذلك، ضع الـ transwell في بئر ثالث يحتوي على أي من الأدوية أو كواشف العلاج. قم بسحب 100 µL من الوسط الذي يحتوي على جاذب كيميائي باستخدام الماصة برفق ووضعه في الـ transwell فوق خليط Matrigel و PBS المتصلب. يتم التحضين لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام عند 37 °C مع 5% CO2 لتصوير الخلايا غير الفلورية التي تغزو Matrigel.

ضع أنابيب النقل (transwells) في أطباق جديدة ذات 24 بئرًا، ثم أضف باستخدام الماصة 1 mL من محلول calcium AM بتركيز 4 µM فوق كل سدادة من الـ matri gel، مع السماح للمحلول بالتدفق على الجوانب لصبغ العينة من الأعلى والأسفل. تُحضن العينات لمدة ساعة واحدة عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% carbon dioxide. بعد ذلك، يتم التصوير باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy).

تتيح طريقة صبغ نمط الحياة الأولى هذه تصور أنماط الغزو. انقل كل جهاز transwell إلى لوحة 24 بئراً جديدة، وأضف 1 mL من 4% paraform aldehyde و 0.2% triton X 100، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة. بعد الغسل ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS، أضف RNAs A لمدة 30 دقيقة، ثم اغسل مرتين باستخدام PBS للتصور بتركيز 0.01 mg/mL.

يُخفف يوديد البروبيديوم في محلول PBS ويُترك في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. تُغسل العينات ثلاث مرات باستخدام محلول PBS. وفي هذه المرحلة، يمكن الاحتفاظ بحجرات نقل (transwells) المصبوغة بيوديد البروبيديوم في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة شهر واحد على الأقل.

تتطلب الطريقة الثانية لصبغ الخلايا التثبيت، ولكنها تسمح بتقدير كمي أسرع للغزو. باستخدام مجهر بؤري مقلوب، ضع جهاز transwell مع كمية صغيرة من PBS المتبقي فوق غطاء شريحة كبير، باستخدام عدسة شيئية بقوة 20 مرة غير مغمورة، والتقط مقاطع بصرية كل 10 إلى 15 ميكرون من قاع سدادة matrigel. قم بقياس مدى الغزو باستخدام المقاطع البصرية الفردية. كما يمكن بناء أجسام ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج مناسبة مثل velocity؛ وفي هذه السلسلة المذكورة من المقاطع البصرية، تم صبغ الخلايا باستخدام calcium am.

وكما هو متوقع، يقل عدد الخلايا التي تغزو للأعلى من المرشح مع زيادة المسافة. ويمكن قياس هذا الغزو كمياً. كما توفر عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لغزو الخلايا تصويراً مرئياً لنمط الغزو.

إذا تم تمييز الخلايا عن طريق التعبير عن البروتينات الفلورية، فيمكن تصور مواقع كل خلية ملونة في عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في هذا العرض الجانبي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر المقاطع العرضية من خلال عملية إعادة البناء رؤى حول الآليات الجزيئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية استخدام مقايسة غزو الخلايا هذه للحصول على معلومات حول عملية التهرب أكثر مما يمكن الحصول عليه باستخدام الطرق القياسية.