التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و خارج الحي الخلايا الليفية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف البيولوجيا المميزة في الواجهة بين الخلايا الظهارية الخبيثة في جبهة الورم الغازية والخلايا اللحمية المرتبطة بالسرطان. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء مزارع الخلايا الليفية الأولية أولا من غرسات القولون. تتمثل الخطوة الثانية في بناء نماذج الزراعة العضوية المشتركة باستخدام الخلايا الليفية القولونية الأولية وخلايا سرطان القولون والمستقيم المستنبتة.

بعد ذلك ، يتم تثبيت النماذج العضوية في الشكلين ، مقسمة على شرائح مثبتة على الغشاء وملطخة باللون البنفسجي الكريستال. الخطوة الأخيرة هي التشريح المجهري بالليزر من أجل فصل الخلايا السرطانية الغازية عن الخلايا السرطانية غير الغازية والخلايا اللحمية المرتبطة بالسرطان. في النهاية ، يمكن استخدام تقنيات التنميط الجزيئي لتوصيف بيولوجيا الخلايا السرطانية الغازية وغير الغازية والخلايا اللحمية في البيئة المكروية للورم المحيطة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا مدى وضوح تمييز الخلايا الغازية عن الخلايا غير الغازية في نماذج الزراعة العضوية المشتركة ثلاثية الأبعاد لسرطان القولون والمستقيم. للبدء ، احصل على عينات من أنسجة الغشاء المخاطي للقولون البشري مباشرة من غرفة العمليات الجراحية في المختبر. ضع عينة في وسط طبق زراعة الأنسجة بطول 10 سم ، ثم اغسل المزرعة ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS المكمل بالبنسلين والستربتومايسين ومنطقة الفطريات.

لا تشفط بعد الغسيل النهائي بالملقط المعقم والمشرط ، وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة. ثم ضع كل قطعة في وسط صليب مرسوم بشفرة المشرط. في صفيحة 12 بئر ، هز المشرط برفق فوق الأنسجة للسماح له بالالتصاق بالثقافة.

العينات في 750 ميكرولتر من وسائط نمو الخلايا الليفية الأولية ، والتي يجب أن تغمر الأنسجة دون تمكينها من الطفو. ثم ضع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية ، من خمسة إلى 10٪ من ثاني أكسيد الكربون خلال الأيام الخمسة المقبلة. ستبدأ الخلايا الليفية في النمو ببطء من حافة الأنسجة في حوالي سبعة أيام.

سيكون هذا أكثر وضوحا بعد حوالي ثلاثة إلى أربعة أسابيع. وإذا كان هناك عدد كاف من الخلايا الليفية التي تنمو ، أضف 750 ميكرولترا من التربسين إلى كل بئر بعد فصل الخلايا وقم بنقلها إلى قارورة ثقافة الأنسجة T 25 للهلام العضوي المشبع بالخلايا الليفية. أولا ، قم بإعداد معلق خلية الخلايا الليفية يحتوي على 500،000 خلية لكل هلام في DMM المكملة.

قم بتكوين المواد الهلامية العضوية على الثلج بالنسب الموجودة في بروتوكول النص لتسعة مواد هلامية بمعدل واحد مليلتر لكل هلام. تحضير 10 مل واخلطها برفق لتجنب الفقاعات. ثم أضف ملليلترا واحدا إلى كل بئر من صفيحة 24 جيدا واحتضنها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب.

للسماح للمواد الهلامية بالتماسك بعد ساعة واحدة ، أضف ملليلترا واحدا من DM EM المكممل فوق المواد الهلامية والعودة إلى الحاضنة طوال الليل. في اليوم التالي. وسط الشفط من أعلى المواد الهلامية ولوحة ملليلتر واحد من الوسط يحتوي على 500،000 الخلايا الظهارية لسرطان القولون والمستقيم لصفائح النايلون المطلية بالهلام.

قم بإعداد صفائح نايلون معقمة بقياس 1.5 سم × 1.5 سم مسبقا باستخدام ملقط معقم. ضع العدد المطلوب من صفائح النايلون في طبق ثقافة 10 سم. قم بإعداد خليط الجل على الثلج كما هو موضح في بروتوكول النص وأضف 0.1 مولي من هيدروكسيد الصوديوم إلى مزيج الجل حتى يتحول إلى اللون الوردي مما يشير إلى أن المحلول قد تم تحييده.

ثم أضف 250 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل لوح نايلون. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة للسماح للهلام بالتماسك. بعد ذلك ، أضف 10 مل من محلول جلوتارالديهايد بنسبة 1٪ في PBS إلى كل طبق استزراع 10 سم.

بمجرد أن يتماسك الجل قبل الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، اغسل صفائح النايلون ثلاث مرات في PBS ومرة واحدة في dme المكملة. احتضان الألواح طوال الليل في نفس المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية لرفع المواد الهلامية العضوية على شبكات فولاذية لشبكات السقالات المعقمة للغزو التي تم تحضيرها عن طريق طي صفائح الفولاذ المقاوم للصدأ في تشكيل ثلاثي القوائم. ثم استخدم الملقط والمعقم والإيثانول لوضع شبكة فولاذية في كل بئر من ستة آبار.

ضع ورقة نايلون مغلفة بالهلام مع جانب الكولاجين لأعلى على كل شبكة. انقل المواد الهلامية العضوية بعناية من صفيحة 24 بئر إلى لوح النايلون المرتفع باستخدام ملعقة ومعقمة وإيثانول. املأ البئر ب D mem المكمل حتى تتلامس لوح النايلون مع الوسط ولكن غير مغمورة.

تأكد من أن الوسيط لا يلمس الجل العضوي. احتضان لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ CO2. استبدال الوسط كل يومين.

قم بإزالة النمط العضوي بالكامل بما في ذلك لوح النايلون من البئر وضعه على غلاف بلاستيكي. قم بتقسيم صفيحة النمط العضوي والنايلون باستخدام مشرط نظيف يمكن التخلص منه وقم بإصلاح كلا النصفين في الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة. في درجة حرارة الغرفة ، استبدل الفورمالديهايد بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد 24 ساعة واتركه طوال الليل قبل تضمينه في البارافين والتقطيع والتلوين لإجراء التشريح الدقيق بالليزر.

القسم الأول ، النمط العضوي بسمك 10 ميكرون على الشرائح المثبتة على الغشاء. بعد معالجة الأقسام كما هو موضح في بروتوكول النص ، استعد لإجراء الفحص الدقيق بالليزر باستخدام نموذج النظام الأساسي المختار. ضع الشريحة الزجاجية مع قسم البقع المراد تشريحها بالميكروس.

ووجهك لأسفل على مرحلة المجهر ، وقم بتركيب أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مليلتر في كاسيت التجميع وأضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا إلى الغطاء الذي ستتجمع فيه الأنسجة التشريح الدقيقة تحت الرؤية المباشرة. استخدم عصا التحكم لتحديد الأنسجة ذات الأهمية واستخدام واجهة البرنامج ، وقم بالتعليق على القسم العضوي الملون ، وتسليط الضوء على الخلايا لتكون دقيقة في جبهة غزو الورم. قم بتوجيه الليزر لإطلاق النار ، والذي يجب أن يقطع القسم المميز ويدفع الأنسجة الدقيقة إلى غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير.

تابع معالجة العينات بطريقة مناسبة لاستخراج المادة التحليلية ذات الاهتمام. تظهر هنا صور التشريح المجهري بالليزر لخلايا سرطان القولون والمستقيم SW 480 التي تغزو السدى العضوي. يستخدم كريستال البنفسجي لتسليط الضوء على الخلايا الظهارية لسرطان القولون والمستقيم.

ثم يتم تحديد جزر الورم الغازية قبل حدوث التشريح بالليزر ونقل القطعة المقطوعة إلى جهاز التجميع. يتم تحديد الخلايا غير الغازية والخلايا اللحمية وعزلها باستخدام نفس المنهجية. تم تحليل الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد عن طريق توصيف الحمض النووي الريبي الصغير لمقارنة الحمض النووي الريبي الصغير المعبر عنه تفاضليا بين الخلايا الموجودة في جبهة الورم الغازية وتلك الموجودة في مناطق الورم الطبقية.

تم فرز البيانات حسب التغيير الكامل وقيم البيانات زائد أو ناقص مزدوجة. يتم تقديم التغيير من تجربة تمثيلية تظهر التعبير الجيني التفاضلي للحمض النووي الريبي الصغير بين خلايا الهامش الغازية وخلايا الهامش غير الغازية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية بناء نماذج عضوية مناسبة تشريحيا وكيفية استخدام التشريح الدقيق بالليزر لعزل مجموعات فردية من الخلايا لمزيد من الدراسة. قف.