تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

يهدف هذا العرض التوضيحي إلى تصوير البروتينات الموسومة فلوريسنتياً في خلايا حية داخل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. أولاً، يتم إنشاء خطوط خلوية مستقرة تعبر عن بروتينات موسومة فلوريسنتياً. ثم تُزرع هذه الخلايا في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد، تليها عملية الحصول على صور بنظام التصوير الزمني (time-lapse) للخلايا المهاجرة باستخدام مجهر كنفوكالي.

وفي الختام، توضح النتائج تموضع البروتين وديناميكيته داخل الخلايا المهاجرة من خلال التصوير بفاصل زمني وتحليل البروتينات الفلورية (FP)، مما يتيح مراقبة ديناميكيات البروتين وتموضعه في الأبعاد الثلاثية وفي الوقت الفعلي. ويوفر ذلك مساراً لمعالجة الأسئلة الجوهرية في هجرة الخلايا؛ على سبيل المثال، كيف يتم تنظيم نقاط الاتصال الالتصاقية بواسطة البروتينات السيتوبلازمية؟

وكيف تتأثر هذه الاتصالات بمثبطات محددة. في طبق P 35، قم باستنبات الخلايا عند درجة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90%، ثم قم بنقل البلازميد المطلوب إلى الخلايا باستخدام lipo 2000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، ضع الخلايا في الحاضنة.

في اليوم التالي، قم بتوزيع الخلايا على طبقين بتري من نوع P one 50 واحضنهما طوال الليل. قم بتجديد الوسط الغذائي لإضافة 50 micrograms per milliliter من G four 18. استمر في استزراع الخلايا تحت تأثير الانتخاب بالمضادات الحيوية لمدة أسبوعين.

افحص المزرعة بحثاً عن مستعمرات مقاومة لـ G four 18. ثم باستخدام مجهر فلوري مقلوب، حدد المستعمرات الموجبة لـ GFP وقم بتمييزها.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد الغسلة الثانية، اترك طبقة رقيقة من السائل لمنع جفاف الخلايا في كل مستعمرة محددة. امسح المنطقة المحيطة بالحافة قدر الإمكان باستخدام مسحة قطنية معقمة، ثم انقل 10 µL من التريبسين فوق المستعمرة.

كرر العملية بسرعة لكل مستعمرة. ثم حضّن الطبق عند 37 °C لفصل الخلايا. تحقق من المظهر المستدير تحت المجهر.

أضف 10 µL من التربسين إلى كل مستعمرة، واستخدم الماصة لفصل الخلايا تماماً عن الطبق. ثم انقل كل مستعمرة من الخلايا إلى بئر واحد في طبق زراعة مكون من 24 بئراً لتكثير المستعمرات المستقرة. بعد ذلك، قم بتقييم التعبير البروتيني للمستعمرات باستخدام تحليل ويسترن بلوت القياسي والتألق المناعي.

قم بتوسيع تعديل سطح الخطوط الخلوية المختارة للزجاج. يوفر الطبق ذو القاع المسطح ارتباطاً مثالياً بالكولاجين. استخدم الماصة لإضافة 300 microliters من محلول السيلنة على الجزء الزجاجي من كل طبق P 35 بفتحة قطرها 10 millimeter.

يتم الحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تُسحب المحلول ويُغسل بالماء المفلتر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. يُزال الماء وتوضع الأطباق على لوح تسخين بدرجة حرارة 50 °C لمدة 1.5 ساعة.

ضع أغطية الأطباق مائلة قليلاً عن حافة الطبق للسماح بالتجفيف. بعد أن تبرد الأطباق المجففة، اسحب 300 µL من محلول glutaraldehyde بتركيز 2% باستخدام الماصة وضعها على الجزء الزجاجي من كل طبق. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة، ثم تُغسل باستخدام PB S ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.

باشر بتعقيم الأطباق بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة. أولاً، قم بترسيب 100 µL من جزيئات التتبع الفلورية عن طريق الطرد المركزي. تخلص من السائل وأعد تعليق الجزيئات في 500 µL من الوسط الزرعي.

قم بإجراء خمس غسلات، ثم أعد تعليق الجسيمات في 30 µL من الوسط. بعد ذلك، قم بحصد الخلايا التي تعبر عن GFP باستخدام التربسين وقم بتحضير معلق يحتوي على 2 مليون خلية لكل mL في أنبوب إبيدور. اسحب 240 µL من وسط النمو باستخدام الماصة. أضف 12.6 µL من heaps بتركيز 1 M، و20 µL من الماء المفلتر، و50 µL من محلول الخلايا، و10 µL من الجسيمات الفلورية.

وأخيراً، أضف 167 µL من كولاجين أدمة البقر، ثم اخلط المحلول جيداً. الآن انقل 80 µL إلى الجزء الزجاجي من الطبق السيليكوني المجهز. يتم التحضين عند 37 °C لمدة 50 دقيقة حتى يتلمر الهلام.

ثم أضف ملي لترين من وسط النمو بعناية. قم بموازنة غرفة المجهر لتصل إلى درجة حرارة مستقرة تبلغ 37 °C لإعادة ملء وسط الخلايا. وللحفاظ على pH متعادل للتصوير بتقنية DIC، استبدل غطاء الطبق بغطاء زجاجي مع شريط رفيع من البارافورم.

قم بتغطية جانب الطبق لمنع التبخر عند استخدام عدسة شيئية غمر زيتية. ضع قطرة واحدة من سائل الغمر على موضع العدسة الشيئية. ضع طبق هلام الكولاجين على منصة المجهر بحيث يتلامس الطبق مع سائل الغمر.

قم بتركيز العينة والبحث عن الخلايا المطلوب تصويرها لتقليل انزياح المنصة. اترك الطبق ليستقر لمدة 45 دقيقة تقريبًا. وقبل البدء في عملية التقاط طويلة، حدد معاملات الحصول على الصور الخاصة بتجارب إضافة المثبط.

قم بتحضير أوساط مكملة تحتوي على العقار بتركيز عمل مطلوب. قم بتجديد وسط الخلايا للحفاظ على درجة pH متعادلة، ولكن لا تغلقها باستخدام perfil. انقل العينة إلى المجهر وابدأ في التصوير عند وقت المعالجة بالعقار.

أوقف الصورة مؤقتاً، ثم التقط الغطاء وأزله بعناية دون تحريك الطبق. قم بشفط الوسط المازي، ثم انقل الوسط المحتوي على العقار إلى الطبق باستخدام الماصة. بعد ذلك، أعد وضع الغطاء بعناية.

يختلف إعداد الـ frap العلوي بين الأنظمة؛ لذا يرجى مراجعة تعليمات الشركة المصنعة. أولاً، قم بضبط المعلمات الخاصة بتصوير الخلايا الحية.

من أجل التبييض الضوئي. اختبر هذه المعاملات على خلايا تدريبية للحصول على قدرة ليزر كافية لتبييض الإشارة الفلورية دون إتلاف الخلية. بعد ذلك، ابدأ في التقاط الصور للعينة مع الحصول على خمس إطارات على الأقل.

بعد ذلك، قم بإزالة اللون الضوئي للمنطقة ذات الأهمية. استمر في الالتقاط طوال وقت الاستعادة. قم بقياس متوسط شدة الفلورسنت للمنطقة التي تمت إزالة لونها ضوئيًا قبل وبعد إزالة اللون الضوئي بمرور الوقت، باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي.

قم بمطابقة منحنى الاستعادة مع المعادلة الأسية. استخرج معاملات نصف عمر التحلل والشدة النهائية من منحنى المطابقة الأسية. ثم احسب الكسر المتحرك عن طريق حساب نسبة شدة الفلورة النهائية إلى الشدة الأولية.

تظهر صور الخلايا الحية ثلاثية الأبعاد هذه خلايا ظهارية سليمة تعبر عن actin GFP. بعد أربعة أيام من الزراعة، شكلت هذه الخلايا كيساً في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد. هاجرت بعض الخلايا على طول سطح الكيس بينما هاجرت خلايا أخرى داخل الجزء الداخلي منه.

يتم تحليل تشوه المصفوفة الناتج عن قوى السحب التي تبذلها الخلايا المهاجرة من خلال إزاحة جسيمات تتبع مدمجة في المصفوفة المحيطة. يوضح هذا العرض تأثير تثبيط كيناز RO على قوة السحب. وتظهر حركات جسيمات التتبع كصورة إسقاط قصوى لنقاط زمنية مختلفة، حيث تم تلوين كل نقطة زمنية بلون اصطناعي.

وبدلاً من ذلك، يتم عرض صور جسيم تتبع فردي على شكل تجميع صوري (montage) لإظهار حركة جسيم التتبع. وبمرور الوقت، تحرك جسيم التتبع هذا باتجاه الحافة الخلفية للخلية المهاجرة ثم ابتعد عنها قبل وبعد إضافة Y 2 7 6 3 2 على التوالي. يتابع تحليل frap الخلايا التي تعبر عن GFP actin أثناء هجرتها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، مما يشير إلى استعادة الفلورة النموذجية بعد تجربة التبييض الضوئي في إعدادات ليزر محسنة، حيث تنخفض كثافة الفلورة في المنطقة المستهدفة بشكل ملحوظ مقارنة بمستوى الخلفية مع الحفاظ على سلامة الخلايا وعدم تضررها.

يوضح هذا الرسم البياني مطابقة منحنى الاستعادة مع دالة أسية. بمجرد إتقان العملية، يمكن أن يستغرق استزراع الخلايا في المصفوفة ساعة واحدة. لا تنسَ أن العمل باستخدام three amino propyl trimethyl قد يكون خطيراً للغاية.

لذا، اتخذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل غطاء fume hood الكيميائي. وتذكر أيضاً الحفاظ على الظروف المعقمة عند العمل مع الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد 3D matrix.