إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام طريقة فعالة للحصول على معلومات متزامنة من أنسجة متعددة حول التعبير البروتيني في مشروع عالي الإنتاجية مثل أطلس البروتين البشري. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال اختيار مناطق ممثلة لأنسجة مثبتة بالفورمالين ومطمورة في البارافين. بعد ذلك، يتم ثقب المناطق المحددة وتجميع العينات المختارة في كتلة بارافين واحدة، فيما يعرف بالمصفوفة النسيجية الدقيقة.

بعد ذلك، يتم قطع مقاطع من مصفوفة الأنسجة المجهرية (TMA) وإجراء الكيمياء النسيجية المناعية. وأخيراً، يتم تحليل نمط التعبير البروتيني ونشر البيانات في أطلس البروتين البشري (human protein atlas). وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح التعبير البروتيني في الأنسجة والخلايا من خلال مصفوفات الأنسجة المجهرية والكيمياء النسيجية المناعية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل إجراء الكيمياء النسيجية المناعية من كتل نسيجية منفردة، في إمكانية الحفاظ على المواد البيولوجية القيمة وزيادة إمكانية تكرار التجارب. ومن المزايا الأخرى لهذه التقنية إمكانية خفض تكاليف ENT وكذلك تقليل وقت المعالجة المختبرية. سيقوم إيان كول باي، وهو فني مختبر من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء للحصول على طول معياري لعينات النسيج الأسطوانية.

قم بتحديد موضع المِسبار. ويُوصى بترك هوامش تتراوح بين 2.5 إلى 3.0 millimeter على كل جانب من كتلة البارافين لتجنب تشقق البارافين عند تركيب القاطعات المناسبة. قم بفك براغي المقبس السداسي التي تثبت القاطعة في مكانها، وضع القاطعة بحيث يكون الأخدود الموجود في محور القاطعة موضوعاً بإحكام مقابل القضيب المعدني في كتلة V البلاستيكية.

أحكم ربط البراغي، مع التأكد من أن حافة المشبك المعدني في وضع أفقي. أدخل خرام المستقبل على اليسار وخرام المانح على اليمين. استخدم مقابض ضبط XY وقراءات الميكرومتر الرقمية الخاصة بها لتحريك الخرامات على طول المحورين X وY.

لإعادة ضبط الجهاز، اضغط على زر zero a BS للتبديل بين البوصة والملليمتر، ثم اضغط على زر inch millimeter. عند استخدام خرامة بحجم 1 mm لقالب بمقاس 9 × 8، يجب أن تكون المسافة بين الثقوب 2 mm مقاسةً بين مراكز الثقوب؛ وذلك لمنع دفع خرامة الاستقبال إلى الأسفل بشكل مفرط مما قد يؤدي إلى تلف الخرامة. قم بضبط أقصى عمق لدفع الخرامة عن طريق وضع كاسيت فارغ في الحامل، وباستخدام برغي إيقاف العمق الموجود في الزاوية العليا اليسرى من دليل Z، اضبط الموضع السفلي لخرامة الاستقبال ليكون أعلى بـ 1 mm من قاع الكاسيت. بعد اختيار وتحديد المنطقة ذات الصلة في مقطع نسيجي وتصميم قالب لإنتاج مصفوفة نسيجية مجهرية، ضع كتلة الاستقبال في الحامل واستخدم أصغر مفك براغي لإحكام ربط البراغي.

تجنب الإفراط في ربط البراغي لمنع انفصال البارافين عن الكاسيت. ادفع مخرزة الاستقبال لأسفل بنحو خمسة مليمترات داخل كتلة الاستقبال، واستخدم المقبض الموجود على المخرزة لتدويرها ذهاباً وإياباً. بعد ذلك، خفف ضغط الدفع لأسفل ببطء حتى تتمكن النوابض من إعادة المخرزة للأعلى.

استخدم النمط لإفراغ الثاقب والتخلص من النواة البارافينية. ثم حرك البرج للتبديل إلى الثاقب المانح. بعد ذلك، ضع جسر الكتلة المانحة مع الكتلة المانحة فوق حامل الكتلة المستقبلة.

استخدم شريحة صبغ بالهيماتوكيسلين والإيوسين مقابلة حيث تم تحديد المنطقة ذات الاهتمام لتحديد مكان النسيج المراد أخذ عينة منه. ثبت كتلة المتبرع يدويًا في موضعها باليد اليسرى وادفع أداة الثقب باليد اليمنى. لا تضغط على المسبار. بما أن محدد العمق لا يمنع حركة أداة الثقب عند الموضع الصحيح لكتلة المتبرع، فمن المهم التوقف عن الدفع عندما تصبح العلامة الثانية مرئية على المسبار.

قم بتدوير مقبض الثاقبة مرة واحدة ببطء. خفف الضغط نحو الأسفل مع الاستمرار في تثبيت كتلة المانح على جسر كتلة المانح. ثم قم بإزالة الجسر وكتلة المانح.

تأكد من محاذاة خرامة المانح مع الثقب الذي تم إجراؤه مسبقاً. اضبط موضع الخرامة باستخدام براغي التثبيت. إذا لم تكن خرامة المانح والثقب الموجود في كتلة المستقبل على استقامة واحدة، فادفع الخرامة لأسفل بحذر حتى يصل طرفها إلى الجزء العلوي من الثقب في كتلة المستقبل.

أثناء الثبات على هذا الوضع، استخدم المِسبار (stylet) لتفريغ عينة النسيج الأساسية في الثقب. يجب أن يكون سطح العينة الأساسية في حالة محاذاة مع سطح القالب. أعِد البرج الدوار إلى ثقب الاستقبال.

انتقل إلى الموضع التالي باستخدام مقابض ضبط XY وكرر العملية مرة أخرى عن طريق ثقب عينة من الكتلة المستقبلة حتى تكتمل المصفوفة. ولإزالة الكتلة المستقبلة، قم بفك البراغي الموجودة في الحامل. ضع الكتلة ووجهها لأسفل على شريحة زجاجية موضوعة على رف مناسب، ثم قم بتسخين الكتلة عند 42 degrees Celsius لمدة 40 minutes.

أخرج الشريحة والكتلة من الفرن، ثم قم بتسوية سطح الكتلة عن طريق مسح الشريحة الزجاجية برفق. ضع الكتلة مع الشريحة الزجاجية على لوح تبريد لمدة 10 دقائق. ثم انزع الشريحة الزجاجية من الكتلة.

أصبحت الكتلة الآن جاهزة لعملية التقطيع. بعد التقطيع، يتم صبغ مصفوفة الأنسجة المجهرية وتحويلها رقمياً باستخدام جسم مضاد للبروتين المستهدف. ابحث عن البروتين في أطلس البروتين البشري عبر زيارة الموقع الإلكتروني www.proteinatlas.org.

أدخل اسم معرف المجموعة (ensemble id) للبروتين المستهدف، أو رقم الوصول في UniProt، أو اسم HGNC، على سبيل المثال: insulin. انقر فوق البروتين المستهدف ومرر لأسفل للوصول إلى ملخص الأنسجة والأعضاء الطبيعية. يوضح العرض العام تعبير البروتين في البنكرياس.

انقر على التبويب. بيانات أنسجة إضافية. ستظهر نافذة عرض الأنسجة الطبيعية مصنفة حسب العضو.

انقر فوق البنكرياس لعرض نتائج الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) لثلاثة أجسام مضادة موجهة نحو البروتين نفسه. انقر فوق الصورة لعرض صورة عالية الدقة للبنكرياس. تظهر في هذا الشكل أمثلة على جودة المصفوفات النسيجية الدقيقة، حيث تظهر مصفوفة مستقيمة ومحاذية بشكل صحيح مع وجود مساحة كافية بين الصفوف والأعمدة وحافة البارافين. وهنا، تظهر بعض النوى قريبة جداً من الحافة، مما يؤدي على الأرجح إلى حدوث مشكلات أثناء عملية التقطيع.

تم تجفيف مصفوفة الأنسجة هذه بالحرارة لفترة طويلة جداً مما أدى إلى انهيارها بسبب غياب القالب الصحيح. وهنا، تظهر مقطعية مقصوصة بشكل صحيح مع أعمدة مستقيمة ومتسقة مصبوغة بصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين. قد يؤدي استخدام شفرة تالفة أو متسخة إلى حدوث تشققات كما هو موضح هنا، أو ظهور مقاطع مضغوطة كهذه.

تظهر خلايا المركز الإنباتي في العقد الليمفاوية معايرة مثالية للأجسام المضادة، مما يؤدي إلى صبغ سيتوبلازمي محدد دون وجود خلفية كما هو موضح هنا. ويحدث الصبغ السلبي أو الضعيف عندما يكون تركيز الجسم المضاد الأولي منخفضاً جداً أو إذا كان البروتين المستهدف غير موجود في الأنسجة المصبوغة مناعياً. أما هذا المقطع النسيجي، فقد تعرض لصبغ مفرط بسبب الارتفاع الشديد في تركيز الجسم المضاد الأولي.

يؤدي اللون الداكن إلى صعوبات في تحديد الموقع داخل الخلية بسبب التداخل، والتفاعل المتبادل، والإيجابية الكاذبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج مصفوفة علامات نسيجية وكيفية استخدامها عند تحليل التعبير البروتيني عن طريق إجراء الكيمياء النسيجية المناعية. كما يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصفح أطلس البروتين البشري لمعرفة التعبير البروتيني في الأنسجة والخلايا البشرية.