ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام طريقة جديدة وسريعة لتضخيم الإشارة للكشف عن الأنواع الفرعية للفيروسات المسببة للإنفلونزا وتوصيفها على شريحة الإنفلونزا، وهي منصة مصفوفة مجهرية منخفضة الكثافة. ويتم تحقيق ذلك من خلال دمج DTPs المبيوتينة واستخدام بادئات ذات نهاية فوسفورية في الطرف 5 لـ تضخيم قطعة جين المصفوفة وقطعة الجين غير التركيبي من مستخلصات RNA الخاصة بالإنفلونزا. ويتبع تفاعل PCR عملية هضم إنزيمي وتجزئة لإنتاج ناتج فيروسي مبيوتين ومضخم قصير أحادي السلسلة، والذي يتم تهجينه بعد ذلك مع المصفوفة.

تستخدم طريقة الكشف بواسطة الثعلب (Fox detection) البلمرة الضوئية لإنماء بقع بوليمرية كبيرة حيث يحدث التهجين، وتُستخدم أنماط التهجين التفاضلية للكشف عن الأنواع الفرعية للفيروسات المسببة للإنفلونزا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الكشف الفلوري القياسي في أنها غير مكلفة نسبيًا وتوفر نتيجة سريعة مرئية بالعين المجردة بحساسية تحليلية مماثلة للفلورة. ورغم ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة في توصيف فيروسات الإنفلونزا باستخدام شريحة الإنفلونزا (flu chip) لأنها طريقة كشف شاملة.

يمكن تطبيق Ampl Fox أيضاً على مجموعة واسعة من الأنظمة الأخرى، مثل مصفوفات دقيقة أخرى منخفضة الكثافة قائمة على الحمض النووي DNA والبروتينات. ومن الناحية النظرية، يجب أن يكون من الممكن اكتشاف أي منتج مرتبط بالبيوتين باستخدام amox. ستقوم بتوضيح الإجراء أمبر تايلور، وهي باحثة مشاركة، وكيفن مولتون، وهو مساعد باحث هنا في Endeavor، واللذان كانا محورين في تطوير جهاز Fox وكيمياء الكشف على مدار السنوات القليلة الماضية.

استخلص الـ RNA الفيروسي من 200 µL من العزلة الفيروسية باستخدام طقم استخلاص الـ RNA الفيروسي ووفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. قم باستعادة 60 µL من الحجم النهائي وخزن المستخلصات عند درجة حرارة -70 °C أو أقل للاستخدام اللاحق. بعد ذلك، قم بتحضير المزيج الرئيسي لـ R-T-P-C-R على الثلج وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

باستخدام خليط من الـ DNTP المرقمنة بالبيوتين (BIOTINYLATED DNTP)، أضف خليط بادئات رقاقة الإنفلونزا، الذي يحتوي على التركيزات الموضحة، إلى الخليط الرئيسي. يجب أن يحتوي بادئ واحد من كل مجموعة على مجموعة فوسفات في الطرف الخماسي (five prime phosphol group) لتسهيل الهضم الإنزيمي. تنتج مجموعة بادئات الإنفلونزا أ (flu a) ناتجاً بطول 1032 زوجاً قاعدياً، بينما تنتج مجموعة بادئات الإنفلونزا ب (flu B) ناتجاً بطول 811 زوجاً قاعدياً.

قم برج المزيج الرئيسي (master mix) سريعاً باستخدام جهاز الرج (vortex) ووزع 18 µL منه في أنابيب PCR ذات جدران رقيقة. بعد ذلك، أضف 2 µL من قالب RNA إلى كل أنبوب تفاعل. انقل أنابيب PCR إلى جهاز الدورات الحرارية (thermal cycler) واستخدم برنامج دورات حرارية بدرجة حرارة تلدين (annealing temperature) مناسبة.

يظهر هنا ملف التدوير المستخدم في هذا المقايسة. قم بتحضير مزيج الهضم الإنزيمي عن طريق دمج 2.2 µL من منظم تفاعل الإنزيم، و0.8 µL من الماء الخالي من النوكلياز و1.0 µL من إنزيم lambda exonuclease لكل تفاعل PCR. أخرج العينات من الدورة الحرارية وأضف أربعة µL إلى كل أنبوب PCR.

أعد العينات إلى الجهاز الدوري الحراري وبرمجه كما هو موضح على 37 °C لمدة 15 دقيقة، تليها 95 °C لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ضع آبار تهجين أحادية الاستخدام حول المصفوفات الدقيقة المراد تهجينها. ثم اغسل الشرائح في 110 mL من الماء المنقى باستخدام هزاز مداري لمدة خمس دقائق.

جفف الشرائح بلمس حافة البئر برفق باستخدام منديل ورقي. اخلط 22 µL من محلول تهجين منظم (two x hybridization buffer) مع كل منتج من منتجات DNA أحادي السلسلة المجزأ خلطاً سريعاً، ثم انقل 40 µL بواسطة الماصة إلى آبار المصفوفة الدقيقة. اترك الشرائح لتتهجن لمدة ساعة واحدة في غرفة رطوبة؛ وبعد التهجين، أخرج الشرائح من غرفة الرطوبة واغسل كل شريحة سريعاً باستخدام 2 mL من محلول غسيل D. ضع الشرائح في حامل الشرائح.

بعد ذلك، أضف 110 milliliters من محاليل الغسيل المنظمة A و B إلى حاويات منفصلة باستخدام هزاز مداري. اغسل حامل الشرائح في المحلول المنظم A بسرعة تتراوح من 60 إلى 90 RPM، وهي السرعة المستخدمة في جميع عمليات الغسيل اللاحقة، وذلك لمدة دقيقة واحدة. ثم أخرج حامل الشرائح من محلول الغسيل A واشطفه سريعاً بمحلول الغسيل D. انقل حامل الشرائح إلى محلول الغسيل B واغسله على الهزاز المداري لمدة خمس دقائق.

بعد الغسيل، جفف المصفوفات الموجودة على كل شريحة برفق باستخدام منديل ورقي، ثم ضع الشرائح المجففة في غرفة الرطوبة. وتحضيراً لخطوات كشف الفوكس (fox) اللونية، اخلط 10 µL من amplitude و 20 µL من 2x amplitude buffer و 10 µL من الماء المقطر لكل مصفوفة سيتم معالجتها، ثم انقل 40 µL من خليط الوسم إلى كل مصفوفة واترك تفاعل الوسم يستمر في غرفة رطوبة مغلقة لمدة خمس دقائق. وأثناء عملية التهجين، قم بتحضير 110 mL من محلول الغسل C في وعاء. وبعد انتهاء عملية الوسم، اشطف كل مصفوفة فوراً باستخدام محلول الغسل D. ضع كل شريحة في حامل الشرائح واغسلها باستخدام محلول الغسل C على الهزاز المداري لمدة خمس دقائق، وبعد الغسل بمحلول C، اغمر حامل الشرائح لفترة وجيزة ثلاث مرات في وعاء يحتوي على ماء مقطر.

لإزالة رواسب الملح، قم بتجفيف المصفوفات كما تم توضيحه سابقاً. تُحفظ المصفوفات في صندوق شرائح معتم حتى يتم التنشيط الضوئي والتصوير، واللذين يجب إتمامهما في غضون 24 ساعة. بعد ذلك، قم بتشغيل قارئ Amli Fox وتأكد من أن برنامج Amli view جاهز للتنشيط الضوئي قبل الكشف عن عينة المصفوفة.

أولاً، حدد الوقت الأمثل للتنشيط الضوئي لجميع العينات باتباع إجراء معايرة قصير. عند الاستخدام اليومي، قم بتدفئة محلول Amplify حتى درجة حرارة الغرفة ورجّه سريعاً باستخدام جهاز المرج (vortex) للمزج، ثم اسحب ثلاث ميكرولتر (3 µL) من مُعزز Amplify وأضفها إلى أنبوبة Amplify ورجّها جيداً. قم بتوزيع 40 ميكرولتر (40 µL) من محلول Amplify بالتساوي على شريحة واحدة فقط في كل مرة لمدة 10 ثوانٍ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات.

أدخل شريحة المصفوفة الدقيقة في حجرة التنشيط الضوئي بجهاز Amplify Reader. ابدأ عملية التنشيط الضوئي باختيار "start" في برنامج PL view باستخدام وقت التنشيط الضوئي الذي تم تحديده في عملية المعايرة. بمجرد الانتهاء، اشطف المصفوفة الدقيقة بـ 2 mL من الماء المقطر لإزالة الزائد من بوليمر amplify clear؛ لقد حدث الآن تكوين البوليمر في البقاع التي تحتوي على DNA المستهدف، ولكن يمكن رؤيته بشكل أفضل.

بعد التلوين، اترك بقع البوليمر لتجف لمدة دقيقتين. ثم وزع قطرتين من صبغة amply red على المصفوفة واترك عملية التلوين تستمر لمدة دقيقتين. بعد التلوين، اشطف الشريحة بسرعة بالماء المنقى وجففها كما هو موضح سابقاً، ثم أدخل الشريحة في حجرة التصوير بجهاز القارئ Amli Fox لالتقاط صورة باستخدام برنامج amli لمعالجة النتائج. تُظهر الصورة الموجودة على اليسار الكشف عن عينة H one N one المستجدة لعام 2009 بواسطة Amli Fox.

بينما تستخدم الصورة الموجودة على اليمين الفلورة التقليدية الناتجة عن ماسح مصفوفات مجهرية فلوري بؤري، يمكن رؤية نفس نمط الكشف العام بسهولة لكلا الطريقتين. ومع ذلك، فإن نتيجة Amli fox مرئية بالعين المجردة. تُظهر هذه الصور نتائج شرائح الفلورة من أصل بشري، H3N2 من أصل بشري، H1N1 من أصل خنزيري، H1N1، ومصفوفة ثعلب سلبية تفتقر إلى إنفلونزا يمكن اكتشافها.

تنتج التسلسلات A اثنين وثلاثة المحددة باللون الأزرق إشارة لجميع أنواع الإنفلونزا الموضحة، ولكن التسلسلات المحددة باللون الأحمر في أسفل اليمين تنتج إشارة فقط لعينة H1N1 ذات الأصل الخنزيري. وتظهر العينة السلبية إشارة في تسلسل تحكم داخلي محدد باللون الأخضر، مما يشير إلى عدم وجود تثبيط أو فشل في تفاعل RT-PCR.

بمجرد إتقان العملية، يمكن تنفيذ الخطوات بأكملها، بدءاً من استخراج العينة من القارورة ووصولاً إلى الكشف عن amox وتفسير النتيجة النهائية، في غضون ست ساعات تقريباً. ويمكن إتمام جزء الكشف عن Ampl Fox من الإجراء، بما في ذلك معايرة الجهاز، في غضون 30 دقيقة تقريباً باتباع هذا الإجراء. كما يمكن إجراء طرق أخرى، مثل تسلسل الجينوم الجزئي أو الكامل، للإجابة على أسئلة إضافية.

صُمم هذا المقايسة للإنفلونزا لتكون بمثابة فحص أولي، لا سيما للعينات التي تظهر نمط تهجين فريد. ونظراً لأن الكشف هو مقايسة عامة، فإننا نأمل أن يجد الباحثون تطبيقات جديدة ومثيرة للاهتمام للمصفوفات الدقيقة منخفضة الكثافة والتي يمكن أن يضيف الكشف فيها قيمة مضافة.