تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات

يوضح هذا الفيديو إجراءً لتحديد حيوية الخلايا في الخلايا التي تعبر عن GFP باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي المعتمد على الصور tally. يتم صبغ الخلايا المنقولة بـ GFP باستخدام طقم تحديد الحيوية tally viability kit dead cell red، والذي يصبغ جميع الخلايا الميتة باللون الأحمر باستخدام propidium iodide، ثم يتم نقل الخلايا بواسطة الماصة إلى شريحة تحليل الخلايا tally وتحميلها في جهاز قياس التدفق الخلوي، الذي يقوم بالتقاط وتحليل صور المجال المضيء (brightfield) وصور الفلورة الحمراء والخضراء. بعد ذلك، يتم إنشاء مخططات توزيع تكرارية (Histograms) لعرض عدد الخلايا، وحجم الخلايا، وشدة فلورة PI، وشدة فلورة GFP مقارنة بطريقة قياس التدفق الخلوي التقليدية.

يمكن لـ Tali توفير بيانات مماثلة فيما يتعلق بحيوية الخلايا والتعبير الجيني. ومع ذلك، يوفر قياس التدفق الخلوي القائم على الصور معلومات بصرية إضافية حول المجتمع الخلوي الذي يتم فحصه. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل قياس التدفق الخلوي أو المجهر الفلوري في أن جهاز قياس التدفق الخلوي القائم على الصور من Tally يوفر معلومات كمية وبصرية في آن واحد حول عينة الخلايا الخاصة بك.

بالإضافة إلى ذلك، فإن جهاز العد (tally instrument) أسهل في الاستخدام وأقل تكلفة ويشغل مساحة أصغر مقارنة بجهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer) أو المجهر الفلوري. وهذا يتيح للباحثين إجراء مقاييس كمية بسرعة، مثل قياس الحيوية في الخلايا التي تعبر عن GFP على طاولة المختبر. في هذا الإجراء، تم نقل بناء فيروسي من GFP يستهدف النواة إلى خلايا U2 OS بتركيز 1×10⁶ خلية/مل، مع صبغ الخلايا الميتة باستخدام propidium iodide، ثم يتم نقل 100 µL من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

لاحظ أن التركيز الموصى به للمقايسة يتراوح بين 1×10⁵ إلى 1×10⁷ خلية لكل milliliter، رغم أن التركيز ليس بالضرورة أن يكون دقيقاً. بعد ذلك، أضف 1 µL من كاشف tally dead cell red. ثم استخدم جهاز الـ vortex لفترة وجيزة للخلط، واحضن خليط كاشف الصبغ والخلايا في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لمدة تتراوح من دقيقة إلى خمس دقائق.

بعد انتهاء فترة الحضانة، انتقل فوراً إلى التحليل باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي المعتمد على الصور من طراز tally. يستخدم جهاز tally شرائح تحليل خلوية بلاستيكية مخصصة للاستخدام مرة واحدة ومصممة خصيصاً لهذا الجهاز. تأكد دائماً من إمساك الشريحة من الحواف عند تحميلها في الجهاز.

انقل 25 µL من العينة ببطء إلى إحدى مناطق تحميل العينات التي تأخذ شكل نصف قمر. هنا، يتم تحميل خلايا التحكم غير المصبوغة وغير المنقولة في الغرفة A، بينما يتم تحميل الخلايا المصبوغة والمعبرة عن GFP في الغرفة B. لإجراء مقايسة الحيوية في الخلايا المعبرة عن GFP، اضغط على G-F-P-R-F-P في الشاشة الرئيسية لجهاز قياس التدفق الخلوي. ستظهر بعد ذلك خيارات المقايسة على اليمين، اختر GFP plus viability.

سيطلب الجهاز بعد ذلك تحديد ما إذا كان يجب تسمية سلسلة العينات لتسمية سلسلة العينات. اضغط على "تسمية الآن" (name now)، ثم اكتب اسم سلسلة العينات باستخدام شاشة اللمس واضغط على "حفظ" (save)، وسينتقل جهاز tally cytometer تلقائياً إلى شاشة القياس.

بعد ذلك، لقياس الفلورة الخلفية، اضغط على علامة تبويب "الخلفية" (background) الموجودة في النصف السفلي الأيمن من شاشة القياس كما هو موضح هنا. يشير الإعداد الافتراضي إلى أنه سيتم تصوير تسعة حقول من الخلايا. الآن، ومع توجيه عينة الضبط بعيدًا عن الجهاز، أدخل الشريحة في فتحة التحميل حتى تتوقف.

تجنب الضغط بقوة على شاشة الخلفية عند إدخال عينة تحكم جديدة من الخلايا غير المصبوغة. سيتم سحب الشريحة تلقائيًا إلى داخل الجهاز، وستظهر صورة حية للخلايا على الشاشة. استخدم مقبض التركيز لضبط الخلايا في مستوى الرؤية المناسب أثناء عملية التركيز.

حرك زر التكبير الأحمر إلى 4x أو 16x. ومن أجل رؤية التجمعات الخلوية بشكل أفضل، يجب أن تظهر الخلايا بلون داكن متجانس مع وجود هالة مضيئة حول كل منها. وكما هو موضح هنا، قد يحدث نقص في تقدير عدد الخلايا عندما يكون الانتقال بين الخلفية وحواف الخلايا غير واضح، بحيث لا تكون حدود الخلايا محددة بدقة.

قد يتم حساب الخلايا بشكل زائد عندما تكون مراكزها ساطعة ومحيطها داكناً. وبمجرد ضبط تركيز الخلايا، اضغط لتشغيل تحكم الخلايا غير المصبوغة. ولقياس الفلورة الخلفية، سيقوم جهاز قياس التدفق الخلوي بالتقاط الصور تلقائياً وعرض صور مصغرة لكل مجال رؤية.

يوفر شريط التقدم تحديثاً مستمراً لعملية التحليل. وبعد اكتمال التقاط الصور، يقوم جهاز قياس التدفق الخلوي بطرد الشريحة تلقائياً وتوفير البيانات الناتجة عن تحليل الصور الملتقطة. وتُعرض البيانات المخزنة في القائمة المنسدلة لتبويب الخلفية.

سيتم تعيين الاسم نفسه لعينة ضابطة الخلفية كما هو مُعين للتجربة. ولتشغيل العينة المُحولة بـ GFP والمصبوغة بـ PI، قم بإزالة الشريحة من الجهاز، ثم اقلبها وأعد إدخالها بحيث تكون العينة المُحولة مواجهة بعيداً عن الجهاز. اضغط على علامة تبويب العينة ثم المس "press" لإدخال عينة جديدة.

عندما تظهر الصورة على الشاشة، استخدم مقبض التركيز لضبط وضوح الخلايا. كما سبق، اضغط بعد ذلك على "run sample" لتشغيل العينة. بعد اكتمال التقاط الصورة، تظهر بيانات التحليل تحت علامة تبويب العينة، ويقوم جهاز قياس التدفق الخلوي بطرد الشريحة تلقائياً بشكل مناسب.

تخلص من شريحة تحليل الخلايا التعدادية. وباعتبارها نفايات ذات خطر بيولوجي، لا يمكن إعادة استخدام هذه الشرائح. وبمجرد تشغيل العينة، يمكن تطبيق عتبات القياس على العينة.

لتحليل مجموعات خلوية محددة هنا، سنقوم بضبط عتبات القياس لتحديد النسبة المئوية للخلايا الحية والميتة. وفي تبويب العينة، ضمن الخلايا التي تعبر عن GFP، يظهر عدد ونسبة الخلايا التي تعبر عن GFP، والخلايا الحية والميتة التي تعبر عن GFP، وإجمالي الحيوية. كما يتم عرض متوسط حجم الخلايا، وعدد الخلايا التي تم عدها، وتركيز الخلايا.

بالإضافة إلى ذلك، تُعرض في أسفل الشاشة مخططات توزيع تكراري (histograms) توضح حجم الخلايا، والفلورة الخضراء، والفلورة الحمراء. ولتحديد بوابة حجم الخلايا، المس الصورة المصغرة لحجم الخلية لفتح المخطط التكراري الخاص بحجم الخلايا لاستبعاد أي حطام خلوي. قم بتحريك أشرطة التمرير الزرقاء لاستبعاد الأحداث الكبيرة والصغيرة على حد سواء.

المس خيار apply لتضمين الخلايا الموجودة ضمن البوابات. بعد ذلك، لإضافة فلورة GFP إلى التحليل، المس الصورة المصغرة للمخطط التكراري GFP لفتحه.

حرك شريط التمرير الأزرق لضبط الحد الفاصل ليكون على يمين أدنى قمة مباشرة. استخدم عينة الضبط كدليل. يتيح ذلك للتحليل تضمين الخلايا الموجبة لـ GFP، واستبعاد الخلايا ذات الفلورة الذاتية.

غالبًا ما يُلاحظ الفلورة الذاتية عندما تتعرض الجزيئات البيولوجية داخل الخلايا للإثارة؛ انقر للتأكيد والعودة إلى الشاشة السابقة. يجب أن تعكس البيانات المعروضة تحت علامة تبويب العينة الآن البوابات وعتبة القطع المحددة لكلتا قناتي الفلورة. بعد ذلك، لفصل الخلايا المصبوغة بـ PI عن الفلورة الذاتية أو أي خلفية موجودة في العينة، اضغط على الصورة المصغرة للمدرج التكراري لـ PI لفتحه مرة أخرى.

ستظهر ذروة عينة الضبط كذروة رمادية في المخطط التكراري. وتمثل الذروة الحمراء فلورية العينة. أما فلورية الخلفية فتظهر كذروة هي الأقرب إلى قيمة RFU صفر في هذا الجهاز.

للقضاء على الفلورة الخلفية في قناة PI، حرك شريط التمرير الأزرق لضبط عتبة الفصل. ولاستبعاد هذه الذروة، استخدم الذروة الرمادية من عينة الضبط كمرجع. وعند ضبط العتبة في قناة PI بشكل مناسب، اضغط على "تطبيق" للتأكيد والعودة إلى الشاشة السابقة، وسيقوم جهاز العد تلقائيًا بإعادة تحليل البيانات وتحديث النتائج في علامة تبويب العينة.

بعد ذلك، وللتأكد بصرياً من تعيين كل خلية بشكل صحيح، اضغط على علامة تبويب التكبير (zoom)، ثم اختر مجال رؤية تم التقاطه لمراجعته بالضغط على الصورة المصغرة. ثم اضغط على علامة تبويب الطبقات (layers). بعد ذلك، اضغط على زر GFP أو PI لعرض الصورة التي تم التقاطها عبر تلك القناة.

اضغط على الزر نفسه مرة أخرى لإزالة الطبقة من العرض أو لدمج الطبقات، والمس الأزرار المقابلة لكل قناة لتحديد كيفية عد الخلايا من خلال قناة معينة. الدوائر التي تلمس الخلايا التي تم عدها من خلال قناة المجال المضيء فقط، والتي لا تعبر عن الفلورة، ستكون محاطة بدوائر زرقاء. يشير هذا إلى أن خلية معينة هي خلية حية تعبر في القناة الخضراء.

سيتم تحديد البروتين الفلوري الأخضر GFP بدوائر خضراء في الخلايا التي يظهر تعبيرها في القناة الحمراء. أما الخلايا المصبوغة بـ pi فسيتم تحديدها بدوائر حمراء وهي تمثل الخلايا الميتة التي يتم حسابها في كلتا القناتين. وسيتم تحديد الخلايا التي تظهر في القناتين الحمراء والخضراء بدوائر صفراء.

يشير هذا إلى أن الخلية تعبر عن GFP ولكنها مصبوغة أيضاً بـ pi وبالتالي فهي ميتة. قد تظهر أحياناً دائرة سوداء على الشاشة، وهي عبارة عن أجسام تم تحديدها ولكن استُبعدت من التحليل بناءً على حجم الخلية.

استمر في ضبط عتبة مخطط توزيع الفلورة التكراري باستخدام الخطوات الموصوفة للتو حتى يتم إحاطة كل خلية تعبر عن الفلورة بدائرة ذات اللون المناسب. يتم حفظ جميع معاملات التحليل تلقائياً في الجهاز، وذلك ضمن علامة تبويب البيانات.

يمكن للجهاز تخزين ملفات البيانات لـ 500 عملية تحليل عينات. وكل ملف يتم تخزينه في علامة تبويب البيانات متاح لإعادة التحليل. ومن خلال اختيار الملف من علامة تبويب البيانات، سيتم إعادة فتحه وتنشيط جميع الرسوم البيانية التكرارية والطبقات لأرشفة البيانات وإنشاء التقارير.

يمكن نقل البيانات المخزنة في الجهاز إلى جهاز كمبيوتر باستخدام محرك أقراص USB. تم نقل بناء فيروسي من بروتين GFP، وهو ضوء خلوي يستهدف النواة، إلى أربعة أنواع ممثلة من الخلايا، ثم صُبغت باستخدام طقم tally viability باستخدام كاشف dead cell red وحُللت بواسطة tally في جهاز قياس التدفق الخلوي كما هو موضح هنا. وقد سجلت كلتا الطريقتين تقريباً نفس النسبة المئوية من تعداد كل نوع من الخلايا التي تعبر عن GFP، إلى جانب النسبة المئوية من إجمالي التعداد التي كانت حيوية وتعبر عن GFP في آن واحد.

تُظهر هذه البيانات أن جهاز قياس التدفق الخلوي Tali قادر على التمييز بين إجمالي تعبير GFP في مجموعة خلوية وتعبير GFP في المجموعة الحية منها. لقد استعرضنا للتو كيفية استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي Tali القائم على الصور لتقييم التعبير الفلوري والحيوية في عينة الخلايا الخاصة بك. وتعمل هذه التقنية على سد الفجوة بين دراسات الخلايا الفردية ودراسات المجموعات الخلوية.

باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي القائم على الصور tally، يمكنك جمع معلومات بصرية كمية ونوعية عن الخلايا الفردية وكذلك عن مجموعات خلوية أكبر. وباستخدام الإجراء نفسه، يمكن إجراء العديد من المقايسات الأخرى بما في ذلك الموت الخلوي المبرمج (apoptosis)، والتعبير عن RFP، وحيوية الخلايا. وبالنسبة للخلايا غير المعبرة، تشمل التطبيقات المحتملة تقييم التعبير الجيني وصولاً إلى دراسات فعالية الأدوية.