تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

تستخدم هذه التجربة التعديل الانتقائي لنظائر البروتين كيناز C لتحديد وظائفها الميتوكوندرية والخلوية في خلايا الأنابيب الكلوية القريبة تحت ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. أولاً، يتم عزل خلايا الأنابيب الكلوية القريبة الأولية من القشرة الكلوية أو خلايا RPCs التي تمتلك تمثيلاً غذائياً تأكسدياً يشبه ذلك الموجود في الأنابيب الكلوية القريبة.

قم بإصابة الخلايا الشبكية العقدية (RPCs) بنواقل غدية تعبر عن الأشكال النشطة وغير النشطة من بروتين كيناز سي (Protein Kinase C). ثم قم بفحص الوظائف الميتوكوندرية المختلفة وحيوية الخلايا لتحديد تأثير الإنزيم على قدرة الميتوكوندريا على تخليق ATP ومنع موت الخلايا. قم أيضاً بإجراء تحليل لطخة مناعية (immunoblot analysis) لبروتين كيناز سي إبسيلون (protein kinase C epsilon) المفسفر في المستخلصات الخلوية التي تم جمعها معاً.

تظهر النتائج أن تنشيط البروتين كاينيز إبسيلون ينظم سلباً قدرة الميتوكوندريا على توليد ATP، مما يقلل من مستويات ATP الخلوية ومن حيوية خلايا الأنابيب القريبة الكلوية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بتقنياتنا الحالية، مثل الخطوط الخلوية، في أن المزارع الأولية لخلايا الأنابيب القريبة الكلوية تحافظ على الوظائف المتمايزة والتمثيل التأكسدي للأنابيب القريبة الكلوية. ونظراً لإمكانية استخدام البروتين كاينيزات كأهداف وعوامل علاجية محتملة، فإن تطبيقات هذه التقنية تمتد نحو العلاج، أو منع إصابة الكلى، أو تسريع تعافي الكلى بعد الإصابة.

يمكن لهذه الطريقة أن توضح آلية الإصابة والتعافي. كما يمكن تطبيقها على أمثلة مثل الكلى المأخوذة حديثاً من الأرانب، حيث تُغسل بالتتابع بـ 50 milliliters من وسط D-M-E-M-F 12 المعقم، ثم بمحلول الفوسفات المنظم المعقم (PBS)، pH 7.4، ثم بمحلول PBS وأكسيد الحديد لحصاد القشرة من كل كلية.

أولاً، قم بتجانس النسيج باستخدام جهاز تجانس سعة 15 milliliter. ثم مرر المستحلب المتجانس عبر غربالين مساميّين معقمين إلى دورق معقم سعة لتر واحد. اشطف الخلايا المتبقية على الغرابيل باستخدام محلول منظم يحتوي على deferoxamine.

انقل أي أنسجة متبقية في قاع المنخل ذو المسام 85 ميكرون إلى 40 milliliters من منظم يحتوي على deferoxamine موضوع في أنبوب طرد مركزي مخروطي. اخلط معلق الخلايا برفق باستخدام المغناطيس القوي.

قم بالتقاط الكبيبات المملوءة بالحديد ثم اسحب الحديد الملتصق بالمغناطيس. اضبط حجم معلق الخلايا ليصل إلى 40 milliliters وأضف 1 milliliter من وسط الهضم الذي يحتوي على collagenase. يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 17 دقيقة.

خلط المعلق بلطف. يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 50 ×g لمدة دقيقتين عند درجة حرارة 4 °C بعد عدة غسلات. ثم يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا في 46 mL من الوسط الذي لا يحتوي على الجلوكوز.

تُزرع خلايا RPT الأولية بكثافة 1 mg من البروتين لكل طبق استزراع في 2 mL من وسط D-M-E-M-F 12 الخالي من الجلوكوز على هزاز مداري عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide. بعد تجديد الأوساط، يتم إصابة خلايا RPT الملتصقة والمكتملة النمو بفيروس غدي يحمل CD NA إما لبروتين kinase C epsilon النشط تأسيسياً أو لبروتين kinase C epsilon السلبي السائد، ثم تُحضن لمدة 24 ساعة، ويُجدد الوسط وتُستزرع خلايا RPC الأولية المنقولة جينياً لمدة 24 ساعة أخرى. ولتصوير المورفولوجيا الميتوكوندرية للطبقة الأحادية من الخلايا الأولية، يُجدد الوسط ويُضاف MIT tracker red 580 ثم تُعاد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يتم فحص الطبقات أحادية الخلية الحية تحت مجهر فلوري باستخدام عدسة غمر مائية. الهدف الثاني: لتقييم الوظيفة الميتوكوندرية، يتم تقدير تنفس الحالة الثالثة لمعلق RPTC في غرفة استهلاك الأكسجين المجهزة بقطب من نوع Clark.

قس أولاً تنفس الحالة الثانية في غياب DP. ثم أضف DP ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.4 millimolar. لبدء تنفس الحالة الثالثة من أجل تنفس الحالة الرابعة، أضف oligomycin ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.5 µg/mL.

قم أيضاً بتضمين قياس للتنفس غير المقترن عن طريق إضافة 0.5 micromolar من FCCP إلى الخلايا التي تتنفس في الحالة الثالثة. أضف ببطء 20 microliters من محلول JC one بتركيز 0.5 millimolar إلى كل طبق مستنبت RPTC وقم بتحريكه لخلط الصبغة جيداً. أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 30 minutes.

بعد ذلك، ضع المستنبتات على الثلج وقم بإجراء غسلتين باستخدام PBS بارد جداً. ثم قم بحصاد الخلايا. انقل خلايا RPT إلى أنبوب إينور وقم بتفكيك الطبقات أحادية الخلية إلى معلق خلوي مفرد عن طريق السحب بالماصة.

حلل الفلورية باستخدام قياس التدفق الخلوي عن طريق الإثارة باستخدام ليزر أرغون أيوني بطول موجي 488 nanometer. ثم احسب جهد الغشاء الميتوكوندري للميتوكوندريا المعزولة. يسهل ذلك تقييم سلامة السلسلة التنفسية.

بعد غسل طبقات RPTC أحادية الخلايا مرتين بمحلول PBS المنظم المبرد بالثلج، يتم حصاد الخلايا وترسيبها عن طريق الطرد المركزي. اغسل الراسب مرة واحدة في 1 mL من المحلول المنظم A، ثم قم بتجانس الخلايا باستخدام مجانس Down حتى تتكسر معظم الخلايا في الناتج المتجانس عند فحصها تحت المجهر. بعد ذلك، قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة.

قم بترسيب الميتوكوندريا الخام من السائل الطافي عند 15,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، وأجرِ ثلاث عمليات غسل للميتوكوندريا المترسبة باستخدام المنظم c. أعد تعليق راسب الميتوكوندريا في 50 إلى 100 µL من منظم المقايسة ثم جمدها في النيتروجين السائل لتقدير نشاط NADH ubiquinone oxidoreductase. أضف 500 µL من منظم المقايسة مع الإضافات والميتوكوندريا، مع تضمين عينة فارغة (blank) تحتوي على جميع الإضافات ولكن بدون ميتوكوندريا. اترك الطبق ليصل إلى حالة التوازن عند درجة حرارة 30 °C مع الخلط لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، ضع الطبق في جهاز القياس الطيفي وأضف 10 µL من اليوبيكوينون بتركيز 3.25 mM لبدء التفاعل في كل بئر. سجل الامتصاصية عند 340 nm لمدة ثلاث دقائق بفواصل زمنية قدرها 22 ثانية. وفي مقايسة مماثلة، قم بقياس نشاط سيتوكروم C أوكسيداز باستخدام السيتوكروم C المختزل كركيزة لتفاعل ATP سينثاز.

قم بتحضير الخلطات الخاصة بمقايسة نشاط APAs الكلي ونشاط APAs غير الحساس للأوليغوميسين لكل مجموعة علاجية. قم بحضن العينات في خلطة التفاعل عند درجة حرارة 31 °C لمدة 10 دقائق. ابدأ التفاعل بإضافة ركيزة TP ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 31 °C لمدة خمس دقائق.

انقل 200 µL من خليط الحضن إلى أنبوب يحتوي على 50 µL من TCA بتركيز 3 M، ورسّب البروتينات على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتجميع الراسب عن طريق الطرد المركزي. ثم قم بتعبئة طبق 96 well بـ 50 µL من كل معيار فوسفات و 50 µL من السائل العلوي لكل عينة في مكررات.

ثم أضف 250 µL من كاشف Sumner إلى كل بئر مع التحضين عند 30 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، سجل الامتصاصية عند 595 nm. اغسل الطبقات الأحادية من RPTC مرتين باستخدام محلول PBS المنظم البارد والمثلج.

احصد الخلايا في 1 mL من PBS وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب إبندورف. قم بترسيب عينات RPTC عن طريق الطرد المركزي وحدد محتوى TP باستخدام طريقة اللوسيفيراز الخاصة بطقم تحليل التألق الحيوي لـ ATP. ولتحليل حيوية الخلايا في أطباق بقطر 35 mm، استخدم خمس طبقات أحادية من RPTC لثلاث مجموعات علاج ضابطة من الخلايا: خلايا موجبة للنخر، وخلايا موجبة للموت الخلوي المبرمج، وضابطة بدون صبغ لطبقين.

أضف 2 µL من cisplatin بتركيز 50 mM إلى المجموعة الثانية. أضف 2 µL من tert butyl hydroperoxide بتركيز 500 mM. بعد صبغ الخلايا باستخدام propidium iodide كما هو مفصل في النص المصاحب، اغسل الطبقات الأحادية باستخدام محلول الربط المنظم (binding buffer).

بعد ذلك، قم بصبغ الخلايا باستخدام ANNEXIN five المقترن بـ ZI كما هو مفصل في البروتوكول النصي. ثم قم بحصاد الخلايا برفق وعلّقها في 500 µL من محلول الربط المنظم (binding buffer)، باستخدام ماسحة مطاطية (rubber policeman).

استخدم ماصة لتفريق الخلايا إلى معلق خلوي أحادي، ثم انقل المعلق الخلوي إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي. قم بتفريق الخلايا إلى معلق خلوي أحادي. انتقل فوراً إلى قياس كمية الفلورة لـ PI و FE عن طريق قياس التدفق الخلوي؛ حيث يؤدي التوصيل الغدي لـ CD NA الذي يغلف الطفرات النشطة بنيوياً وغير النشطة لبروتين kinase C epsilon إلى زيادة مستويات بروتين protein kinase C epsilon بشكل ملحوظ في RPTC وفي الميتوكوندريا.

وكما هو متوقع، فإن الشكل النشط بنيوياً للإنزيم يتم فسفرته في خلايا RP tcs، بينما لا يتم فسفرة الإنزيم السلبي السائد. ويؤدي وجود بروتين كيناز C إبسيلون النشط إلى خفض التنفس الميتوكوندري في RPTC بغض النظر عن الركيزة المستخدمة لتزويد الميتوكوندريا بالطاقة. أما بروتين كيناز C إبسيلون غير النشط، فلا يكون له أي تأثير على التنفس الميتوكوندري.

ومن المثير للاهتمام أن تنشيط البروتين كاينيز C إبسيلون في RP TCS يقلل من نشاط المركبات واحد في أربعة. ويرتبط هذا الانخفاض في تنفس RPTC بزيادة في جهد الغشاء الميتوكوندري. أما الطفرة السلبية السائدة فلا تمتلك هذا التأثير.

ترافق هذه التغييرات أيضاً انخفاضات في نشاط سينثاز TP في الميتوكوندريا المعزولة من RPTC التي تفرط في تعبير البروتين كيناز C epsilon النشط. ونتيجة لذلك، ينخفض محتوى ATP في RPTC التي تفرط في تعبير البروتين كيناز C epsilon النشط؛ حيث يؤدي التنشيط المستمر للبروتين كيناز C epsilon إلى تأثيرات عميقة على مورفولوجيا الميتوكوندريا، كما يتضح من تجزؤ الميتوكوندريا.

تنشيط بروتين كيناز C، وليس تثبيطه، يؤدي أيضاً إلى تغيرات في مورفولوجيا الخلايا النبيبية القريبة في الكلى (RPTC)، مما يسبب انكماش الخلايا واستطالة الخلايا الناجية. كما ارتبطت هذه التأثيرات الميتوكوندريالية الناتجة عن الإفراط في التعبير عن بروتين كيناز C إبسيلون النشط في الخلايا النبيبية القريبة (RPCs) بموت الخلايا عن طريق كل من النخر والapoptosis.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية التعبير المفرط عن البروتينات في المزارع الأولية باستخدام تقنية الفيروسات الغدانية، وكيفية تقييم القدرة الميتوكوندرية لتخليق TP. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وكإجراء وقائي، لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات الغدانية ينطوي على مخاطر، لذا اتخذ الاحتياطات المناسبة.