تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة آثار التعرض للإيثانول على أسماك الزيبرا النامية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعريض أسماك الزيبرا لجرعات من الإيثانول في مياه الأجنة العادية خلال مرحلة النمو المبكر. بعد ذلك، يتم إزالة الإيثانول وتُترك الأسماك لتنمو حتى الوصول إلى النقطة الزمنية المطلوبة.

بعد ذلك، يتم تحليل كل من التغيرات الفيزيائية الظاهرية والتغيرات في التعبير الجيني في الأجنة المعالجة مقارنة بالأجنة الضابطة. وأخيراً، يتم التعامل مع الأجنة باستخدام mRNA، أو المورفولينو (morpholinos)، أو العقاقير لتحديد ما إذا كان يمكن تعديل العيوب التنموية الناجمة عن الإيثانول. وفي نهاية المطاف، أظهر الجمع بين تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) والتهجين الموضعي (in situ hybridization) أن تأثيرات الإيثانول على أجنة سمك الزيبرا النامية مرتبطة بتغير في التعبير الجيني.

قد يؤدي التلاعب اللاحق بمستويات التعبير الجيني إلى تحسين أو منع العيوب التنموية الناجمة عن الإيثانول. إن التقنيات التي نستعرضها اليوم توسع معرفتنا بطبيعة متلازمة الجنين الكحولية، بالإضافة إلى الحفاظ على العمليات التنموية في الفقاريات. وستقوم ستيف إرهاردت، الفنية في مختبري، اليوم بتوضيح كيفية معالجة الأجنة بالإيثانول.

قم بتربيتها من تزاوجات النوع البري (wild type) وصولاً إلى مرحلة القبة (dome stage) عند درجة حرارة 28 درجة Celsius في ماء الأجنة. قسّم الأجنة من مجموعة واحدة إلى العدد المطلوب من الأطباق، بحيث يحتوي كل طبق على ما بين 10 و 50 جنينًا. أضف إلى الأجنة محلولاً من الإيثانول بتركيز يتراوح بين 0.2 إلى 2.5% حجم/حجم في ماء الأسماك، ثم أعدها إلى الحاضنة لمدة تصل إلى 24 ساعة بعد فترة التعرض المطلوبة.

استبدل الإيثانول المحتوي على الماء بماء أجنة طازج لفترة محددة من التطور لجمع mRNA من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR). ضع الأجنة المتطابقة H في أنابيب إبندورف. قم بإزالة ماء الأسماك وأضف محلول التحلل (lysis buffer) الذي يحتوي على TCEP.

باستخدام مسحوق آلي، قم بفصل الأجنة ميكانيكياً ثم ضعها في جهاز الطرد المركزي لإجراء دوران بطيء. انقل المذاب إلى عمود تصفية أولية، ثم قم بطرد العمود مركزياً لإزالة القطع الكبيرة المنفصلة.

استخدم طقم عزل RNA لاستخلاص الـ RNA. ثم قم بتخليق CDNA باستخدام الطرق القياسية لتحليل QPCR أو المصفوفات الدقيقة (microarray) لتحضير الأجنة لعمليتي التهجين الموضعي والصبغ بالأجسام المضادة. قم بتثبيت الأجنة في المرحلة من 6 إلى 24 ساعة بعد الإخصاب في 4% para formaldehyde طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، متبوعة بثلاث غسلات بمحلول PBS مضاف إليه 0.1% tween.

قم بإزالة الغشاء الكوريوني (choon) باستخدام ملقطين حادين تحت المجهر. بعد ذلك، انقل الأجنة إلى الميثانول عبر سلسلة من عمليات تغيير السائل بزيادة تركيز الميثانول وتقليل تركيز PBT. بعد نقل الأجنة إلى ميثانول 100%، احفظها في درجة حرارة 20- درجة مئوية لصبغ الغضاريف.

تُربى الأجنة حتى اليوم الخامس أو السادس بعد الإخصاب. تُثبّت طوال الليل في 4% paraform aldehyde عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. بعد ذلك، تُغسل ثلاث مرات في PBT لتحديد مستويات التعبير الجيني التي تغيرت نتيجة التعرض للإيثانول.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (QPCR) من خلال تصميم البادئات أولاً للتحقق من كفاءتها. اختبرها على ثلاث عينات بيولوجية، ويمكن أن تكون هذه العينات البيولوجية الضابطة من أي عمر طالما أن الجين المستهدف يتم التعبير عنه في ذلك العمر المحدد.

بمجرد التحقق من البادئات، استخدم الـ CDNA الذي تم تحضيره مسبقاً لإجراء QPCR مع تشغيل العينات في ثلاث مكررات وتضمين عينة ضابطة؛ وبالنسبة لضابط سمك الزيبرا، نستخدم البادئات الخاصة بـ gap dh. قم بتطبيع النتائج وفقاً لمستويات gap DH. ثم احسب المستوى النسبي للتعبير الجيني باستخدام الطريقة القوية.

تفاوت في طريقتين من طرق delta delta CT يوضح الفرق في العينة التجريبية بالنسبة للنوع البري. في C، بناء تهجين ثنائي. مسابير ribo معلمة للجين المستهدف.

بعد ذلك، يتم تحضينها مع أجنة متوافقة في العمر باستخدام ظروف قياسية، والكشف عن نمط التهجين باستخدام الفوسفاتاز القلوي، وتصوير العينات باستخدام مجهر تشريحي لتقييم التطور المورفوجيني، مثل شكل الجسم، وتصوير الأجنة الحية لتقييم المسافة بين العينين وطول الجسم. أولاً، يتم تثبيت الأجنة في البارافورمالدهيد، ثم تُجمع الصور لفحص آثار المعالجة بالكحول على تراكيب الغضاريف النامية في اليرقة المصبوغة.

تثبيت أجنة سمك الزيبرا باستخدام lc والضوء الأزرق لعدة ساعات أو طوال الليل لضمان تثبيت الأجنة وترويقها قبل التصوير. يتم تحليل موت الخلايا في الأجنة الحية عن طريق تحضينها في 5 mg/mL من aine orange في PBS لمدة ساعة واحدة. تُغسل الأجنة ثلاث مرات في PBS، ثم تُثبت الأجنة على شرائح، وتُصور العينات باستخدام مجهر كونفوكال مع استخدام Z series لإنشاء صور مركبة.

بعد تحديد الجينات التي انخفض تعبيرها نتيجة التعرض للإيثانول، يتم حقن 25 إلى 200 picograms per nanoliters من mRNA المغلّف للجين المستهدف في مرحلة الخلية الواحدة أو الخليتين. تُترك البيوض لتتعافى في حاضنة مسخنة عند 28 degree Celsius حتى تصل إلى مرحلة القبة (dome stage)، ثم تُعالج بالإيثانول كما في السابق. أما بالنسبة للجينات التي زاد تعبيرها نتيجة التعرض للإيثانول، فيتم تثبيطها عن طريق حقن كميات تتراوح من picogram إلى nanogram من morphos مضادة للمعنى (antisense morphos) في الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة أو الخليتين.

يتشابه هذا البروتوكول مع ذلك المستخدم لـ mRNA المزود بغطاء (capped mRNA). في حالة حقن mRNA أو morphino مُحفز للتوصيل (splicing morpho)، قم بقياس الكفاءة باستخدام R-T-P-C-R لمقارنة كميات النسخ الموصلة وغير الموصلة لتحليل نشاط الجينات المعتمد على الجرعة، ثم قم بمعايرة الـ morphino المحقون واترك الأجنة لتنمو حتى المرحلة المطلوبة قبل معالجتها بالإيثانول. يؤدي تعريض أجنة Zebra fish للإيثانول إلى ظهور عدد من العيوب التنموية والجينية التي ترتبط بالأنماط الظاهرية الموجودة في الفقاريات الأخرى.

يؤدي التطور غير الطبيعي للأنسجة المحورية، بما في ذلك Noor، إلى قصر noord وانقطاعه أحياناً، مما يؤدي جزئياً إلى التشوهات اللاحقة في الجسيدات (somites) كما هو موضح هنا. وبينما تظهر الضوابط غير المعالجة شكلاً قوياً يشبه حرف V (chevron shape)، فإن الجسيدات المعالجة بالإيثانول تتخذ مظهراً يشبه حرف U، وهو المظهر الذي يظهر عند انخفاض إشارات sonic hedgehog. كما هو موضح هنا.

من العواقب الأخرى للتعرض للإيثانول، والتي قد تكون ناتجة عن التأخر النمائي المبكر وما يتلوه من عيوب في الجهاز العصبي، قصر طول الجنين. وتتشابه هذه النتيجة مع استمرار مرحلة ما قبل البلوغ وقصر القامة الملاحظ لدى الأطفال الذين تعرضوا للإيثانول أثناء النمو، مما يشير إلى أن نموذج سمك الزيبرا ملائم لفهم هذا العيب الخلقي البشري. وقد ثبت في النماذج الحيوانية أن التعرض الشديد للإيثانول يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرية واضحة لمتلازمة الجنين الكحولية، بما في ذلك الصغر الرأسي واعتلال الرؤية.

في أسماك الزيبرا، تتناقص المسافة بين العينين أو IOD بطريقة تعتمد على جرعة الإيثانول، بما يتفق مع طبيعة العيب الخلقي لدى البشر. ولا تظهر حالة انعدام العينين (Opia) إلا مع الجرعات العالية جداً، ولكن الجرعات المنخفضة تؤدي إلى انخفاض ملحوظ في IOD، مما يشير إلى أن هذا النموذج الحيواني يعاني من عيب مماثل في تطور خط المنتصف الوجهي. وفي هذا الشكل، تتم مقارنة مستويات التعبير الجيني المبكر لكل من six three B و glee one في الأجنة غير المعالجة والأجنة المعالجة بالإيثانول.

أظهر كلا الجينين انخفاضاً في مستويات التعبير في العينات المعالجة بالإيثانول. وباستخدام التهجين المزدوج (NC)، تم تحليل أنماط التعبير لـ six3B و gooID كما هو موضح. وهنا، أظهر كلا الجينين انخفاضاً في التعبير المكاني في الأجنة المعالجة بالإيثانول مقارنة بالمجموعات الضابطة غير المعالجة.

بما أن كلا الجينين يتم التعبير عنهما في الأنسجة المقدر لها أن تصبح أنسجة الخط المتوسط للوجه والجمجمة، فإن انخفاض مستوياتهما بعد ثماني ساعات من الإخصاب يتوافق مع الانخفاض في IOD في مرحلة لاحقة من النمو. وبمجرد تحديد الجينات التي تتأثر بالإيثانول، تتوفر آليات يمكن من خلالها زيادة تعبيرها أو تقليله. وفي هذا المثال، تم حقن mRNA لبروتين sonic hedgehog، وهو ربيطة تزيد من مستويات glee one، وقد أدى ذلك إلى معالجة العيوب الظاهرية الناتجة عن انخفاض مستويات glee one في الأجنة المعالجة بالإيثانول.

ومع ذلك، لم يتمكن حقن six three B من إنقاذ النمط الظاهري الناتج عن التعرض للإيثانول. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استكشاف العيوب الجينية والتنموية التي يسببها الإيثانول في جنين سمكة الزيبرا النامي. كما يمكن تطبيق التقنيات المستخدمة هنا من قبل الراغبين في دراسة سمية المركبات الأخرى القابلة للذوبان في الماء على الجنين النامي للفقاريات.