وحيد الخلية تحليل الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير وتقدير المجموعات الفرعية المتميزة من الخلايا المتخصصة التي تتمايز في الأغشية الحيوية للكائن النموذجي، bacillus subtles. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إدراج مراسلات نسخ في كروموسوم B subtles. وستتم التعبير عن هذه المراسلات حصرياً في المجموعة الفرعية من الخلايا قيد الدراسة.

تتمثل الخطوة التالية في تحفيز تكوين الغشاء الحيوي (biofilm) عن طريق تنمية بكتيريا B subtles في وسط تحفيز الغشاء الحيوي، Ms GG gg. وبعد تكوين الغشاء الحيوي، يتم تشتيت الخلايا الموجودة فيه وتثبيتها باستخدام البارافورمالدهيد. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي الكشف عن إشارة الفلورسنت المنبعثة من الخلايا المفردة للمجتمع الميكروبي باستخدام المجهر الفلوروسنتي وتدفق الخلايا (flow cytometry).

وفي نهاية المطاف، توضح النتائج كيفية تخصص الخلايا للإنتاج والإفراز. حيث تمثل المصفوفة خارج الخلية التي تشكل الغشاء الحيوي ركيزة فرعية مختلفة عن الخلايا التي تفرز المادة الخافضة للتوتر السطحي، وهي الجزيء الإشاري المسؤول عن تمايز الركيزة الفرعية من منتجي المصفوفة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل قياس التعبير النسخي باستخدام مقايسات Vita Ities أو تحليل المصفوفات الدقيقة، في أنها تسمح لنا بمراقبة التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة وتصور المجموعات الخلوية الصغيرة بشكل خاص من الخلايا المتخصصة في التعبير عن جين معين.

لن يتم الكشف عن تعبيرات هذه الجينات عند تحليل المجتمع العام. تُستخدم البلازميدات التكاملية لوسم سلالات B subtles، وموضح هنا مثال على ذلك. PTAA هو المحفز للجينات المسؤولة عن إنتاج tass.

يتم استنساخ بروتين مصفوفة في الناقل باستخدام مواقع التقييد ECO R one و Hindi three. وأصبح التعبير عن الجين المراسل CFP الآن تحت تحكم ptap A. لبدء إجراء الوسم لـ B. subtles، قم بكسر خطية البلازميد التكاملي عن طريق الهضم الإنزيمي. إنزيم التقييد الموصى به هو XH oh one. عندما يصبح البلازميد التكاملي جاهزًا، قم بتحفيز الكفاءة الطبيعية في سلالة B subtlest 1 68 عن طريق تنمية الخلايا في وسط تحفيز الكفاءة لمدة خمس ساعات عند 37 °C.

أضف البلازميد الخطي إلى مزرعة خلايا B subtilis المختصة واحضنها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد مرور الساعتين، ازرع الخلايا على أغار يحتوي على spectinomycin واحضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. يحتوي كروموسوم B subtilis على موقعين محايدين، وهما Amy E و LAC A، واللذان يمكن استخدامهما لدمج الاندماجات المراسلة دون التأثير على تطور الغشاء الحيوي الرقيق (biofilm). يندمج البلازميد الخطي PKM 0 0 8 في جينوم B subtilis عن طريق إعادة الاتحاد المزدوج.

تتمثل الخطوة التالية في نقل المراسل من السلالة المسمى إلى سلالة قادرة على تكوين الأغشية الحيوية باستخدام بروتوكول نقل الفاج SPP الواحد. ولأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض الخطوات المهمة فقط في البروتوكول. قم بتنمية السلالة المانحة 1 68، التي تحمل اندماج المراسل، في وسط TY عند 37 °C حتى تصل المزرعة إلى المرحلة الثابتة المبكرة، ثم ضع 200 µL من الخلايا مع 100 µL من مخزون الفاج المخفف في أنبوب زجاجي.

ثم تُترك عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يتم نقل الآجار الناعم TY الساخن بالماصة إلى الأنبوب والمزج جيداً باستخدام جهاز الـ vortex. يُنشر المزيج بلطف على طبق TY جديد ويُحضن عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح بين 8 إلى 16 ساعة للسماح بظهور هالات العاثيات.

لجمع هالات العاثيات، أضف ثلاثة مللي لتر من وسط TY إلى الطبق واستخدم الماصة الزجاجية لتفتيت الآجار العلوي. انقل معلق الآجار إلى أنبوب فالكون سعة 15 مللي لتر. استخدم جهاز vortex برفق لتفتيت الآجار، ثم قم بالطرد المركزي عند 1000 G لمدة 15 دقيقة.

انقل الطافي إلى أنبوب جديد. مرر الطافي عبر مرشح حقنة بمسامية 22 micron. استخدم هذا الطافي لإصابة مزرعة من السلالة المستقبلة التي تم إنماؤها في وسط TY.

أضف 30 µL من الطافي إلى 10 mL من المزرعة المخففة بنسبة 1:10، وحضّن المزيج لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي بسرعة 5,000 RPM لمدة سبع دقائق، ثم أعد تعليق الراسب في 200 µL من وسط TY وانشره على طبق يحتوي على SPECTmycin و 10 mM من سترات الصوديوم.

يتم التحضين عند 37 °C لمدة تتراوح من 12 إلى 36 ساعة. يتم اختيار مستعمرة واحدة وتنميتها طوال الليل في وسط LB السائل عند 37 °C. وأخيراً، يتم وضع 3 µL من المزرعة التي نمت طوال الليل على وسط صلب محفز لتكوين الغشاء الحيوي الرقيق.

اترك الخلايا تنمو لمدة 72 ساعة عند 30 درجة مئوية. وبعد ثلاثة أيام من النمو، ستطور الأغشية الحيوية المتكونة على سطح آغار Ms.GG بنية مورفولوجية معقدة على سطح الآغار. لبدء هذا الإجراء، استخدم خلة أسنان أو ملقطاً لإزالة الغشاء الحيوي من سطح آغار MSGG.

يجب أن تسمح قوام الغشاء الحيوي (biofilm) بإمكانية تقشيره عن سطح الآجار. ضع الغشاء الحيوي كقطعة واحدة في 3 mL من محلول PBS المنظم، وقم بتشتيت الغشاء الحيوي بلطف. قم بإجراء 12 نبضة بقوة خارجة تبلغ 3 وسعة قدرها 0.7 s لتثبيت العينات قبل إجراء تحليل الخلية الواحدة.

أعد تعليق 300 µL من معلق الخلايا في 1 mL من محلول بارافورمالديهيد بتركيز 4%، واحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق بالضبط. بعد عملية التثبيت التي استمرت سبع دقائق، اغسل الخلايا في محلول PBS المنظم ثلاث مرات. وأخيراً، أعد تعليق الخلايا في 300 µL من محلول PBS المنظم قبل إجراء الفحص بالمجهر الفلوري.

قم بتجهيز شريحة المجهر عن طريق سحب 200 µL من agros بتركيز 0.8% ووضعها فوق الشريحة، ثم تغطيتها بعناية بشريحة أخرى. بعد مرور دقيقتين، قم بإزالة الشريحة العلوية برفق للحصول على طبقة من agros ملتصقة بالشريحة في المنطقة السفلية. ضع 2 µL من الخلايا المثبتة على سطح طبقة agros وقم بتغطيتها بغطاء شريحة مجهرية.

ضع العينة على منصة المجهر الفلوري. اضبط فترة الاستثارة وفقًا لعينة ضابطة سالبة لا تظهر أي فلورة في الظروف المختارة للتجربة. يجب أن يتراوح زمن التعريض بين 50 إلى 200 milliseconds.

التقط صورة فلورية وصورة بالمجال المضيء لكل مجال رؤية. ولتحضير الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي، قم بتشتيت عينة الخلايا المثبتة عن طريق الموجات فوق الصوتية الخفيفة. نفذ سلسلتين من 12 نبضة بقدرة 5 وسعة 0.7 ثانية لتشتيت التكتلات إلى خلايا مفردة دون التسبب في تحلل الخلايا.

تحقق من كفاءة تشتت الخلايا باستخدام المجهر الضوئي. بعد ذلك، خفف العينة بنسبة 1 إلى 100 في محلول PBS المنظم. سيتم استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي BD fax canto two لتحليل فلورة YFP.

يُستخدم تحفيز بالليزر عند 488 nanometers مقترن بمرشح 5 30 30 لفلورة CFP. ويُستخدم تحفيز بالليزر عند 405 nanometers مقترن بمرشح 4 0 8 40، ثم يتم معايرة جهاز قياس التدفق الخلوي باستخدام ضابطين سلبيين. يجب أن تُستخدم عينة من محلول PBS المنظم بدون خلايا معلقة كضابط سلبي لحجم الجسيمات التي يستشعرها جهاز قياس التدفق الخلوي.

يجب أن تعمل عينة بدون مراسل فلوري كضابط سلبي لحساسية الفلورة في جهاز قياس التدفق الخلوي. بعد المعايرة، ضع العينة المسمى عليها بمراسل فلوري في جهاز قياس التدفق الخلوي، وبالنسبة لكل عينة، يتم تحليل ما لا يقل عن 50,000 حدث بمعدل تدفق يتراوح بين 303,000 حدث في الثانية. عندما تنمو B Subtles على طبق من الوسط المحفز لتكوين الغشاء الحيوي MSGG، يُلاحظ تكوين الغشاء الحيوي بعد ثلاث أيام من التحضين عند 30 °C.

يُظهر الغشاء الحيوي (biofilm) بنية مورفولوجية معقدة تشير إلى المجموعات الفرعية المتميزة للخلايا المشاركة. على سبيل المثال، يؤدي إنتاج المصفوفة خارج الخلوية والأغشية الحيوية إلى تكوين تجاعيد على سطح المستعمرة. يوضح هذا الشكل مثالاً لتصور تمايز الخلايا في سلالة واحدة مُوسومة باستخدام المجهر الفلوري.

تحمل هذه السلالة المراسل الفلوري Ptap, A CFP الذي يتم التعبير عنه في المجموعة الفرعية من الخلايا المنتجة للمادة الخلالية (matrix) والملونة باللون الأزرق. تقوم هذه المجموعة الفرعية بإنتاج وإفراز المادة الخلالية خارج الخلوية التي تشكل الغشاء الحيوي الرقيق (biofilm). الصورة التالية هي نتيجة التصوير باستخدام المجهر الفلوري لسلالة موسومة مزدوجاً تحمل المراسل Ptap, A CFP، والمراسل الإضافي P Surfactin YFP.

يتيح هذا المراسل الثاني مراقبة المجموعة الفرعية من الخلايا المسؤولة عن إفراز جزيء الإشارة surfactin، والذي يحفز سلسلة إشارات تمايز منتجي المصفوفة. هنا، تم تلوين منتجي المصفوفة باللون الأزرق (تلوين اصطناعي)، بينما تم تلوين منتجي surfactant باللون الأصفر (تلوين اصطناعي)، وهي نتائج قياس التدفق الخلوي ثنائي الأبعاد باستخدام سلالة واحدة موسومة تحمل المراسل ptap. يتم عرض YFB هنا.

أظهرت سلالة التحكم غير المعالجة، والتي تفتقر إلى أي جينات لبروتينات فلورية، مجتمعاً واحداً من الخلايا التي تحمل ptap ذات فلورة نسبية منخفضة. ولم يتمكن بروتين YFP، في ظل ظروف غير محفزة لتكوين الغشاء الحيوي، من تمييز المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية، كما أظهر المجتمع بأكمله فلورة نسبية منخفضة. وفي المقابل، تبيّن تحت ظروف تحفيز تكوين الغشاء الحيوي وجود مجموعة فرعية من الخلايا ذات فلورة نسبية عالية، ظهرت ككتف على يمين منطقة الفلورة النسبية المنخفضة.

تظهر هنا نتائج القمم التي تم الحصول عليها من قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد. تُمثَّل إشارات الفلورة للقنوات المراقبة على المحور X لبروتين YFP والمحور Y لبروتين CFP؛ حيث يوضح اللوح العلوي الأيسر سلالة لا تحتوي على جينات البروتين الفلوري كعينة ضابطة للفلورة الخلفية. وفي اللوح العلوي الأيمن، استُخدمت سلالة واحدة مُعلمة للكشف عن المجموعة الفرعية من المنتجين لمادة surfactin في قناة فلورة YFP المؤطرة باللون الأصفر.

في اللوحة السفلية اليسرى، تم استخدام سلالة واحدة مختلفة موسومة للكشف عن المجموعة الفرعية من منتجي المادة الخلالية (matrix producers). وفي قناة فلورة CFP المؤطرة باللون الأزرق، يتم رصد المجموعات الفرعية من منتجي المادة الخلالية ومنتجي المواد الخافضة للتوتر السطحي (surfactant producers) باستخدام السلالة الموسومة المزدوجة، وتُعرض النتائج في هذه اللوحة السفلية اليمنى.

يتم الكشف عن مجموعتين فرعيتين من الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من المراسلين الفلوريين. يتم تأطير كل مجموعة لإظهار عدم وجود تداخل في تعبير المراسلين بين المجموعتين الفرعيتين من الخلايا المتخصصة. يوضح هذا الشكل النهائي التحديد الكمي للمجموعات الفرعية من منتجي المصفوفة والخلايا الآكلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ثلاثي الأبعاد (3D flow cytometry).

في اللوحة العلوية اليمنى، استُخدمت سلالة واحدة مُوسومة للكشف عن المجموعة الفرعية من آكلي بني جنسهم. وفي قناة فلورة YFP المؤطرة باللون الأصفر، تم وصف هذه المجموعة الفرعية من آكلي بني جنسهم لتمتيازه بشكل منسق مع المجموعة الفرعية من منتجي المصفوفة. وفي اللوحة السفلية اليسرى، تم الكشف عن المجموعة الفرعية من منتجي المصفوفة في سلالة أخرى مُوسومة واحدة في قناة فلورة CFP.

أظهرت النتائج المستمدة من السلالة مزدوجة الوسم في اللوحة اليمنى السفلية، والمؤطرة باللون الأزرق، مجموعة فرعية واحدة من الخلايا الفلورية التي تعبر عن كل من YFP و CFP المؤطرة باللون الأخضر. ويشير التعبير المتزامن للمراسلين إلى أن كلا مساري تمايز الخلايا يتم تنشيطهما بشكل منسق في نفس المجموعة الفرعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس المجموعات الفرعية المتميزة من الخلايا التي تشكل الغشاء الحيوي الميكروبي باستخدام تحليل الخلايا لمجتمع الخلايا مثل المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي.