مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

الهدف من هذه التجربة هو تحديد الجين أو الجينات المسؤولة عن السلامة المورفولوجية والوظيفية لعضيات النبات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة إيثيل ميثان سلفونات كعامل كيميائي لإحداث طفرات في بذور Arabidopsis التي تحمل وسمًا فلوريًا للعضيات. وتتمثل الخطوة الثانية في جمع البذور من نباتات فردية من الجيل الطافر الأول لزراعة سلالات من الجيل الطافر التالي M2.

بعد ذلك، يتم فحص بذور Eliana الطافرة باستخدام مجهر بؤري أو مجهر فلوري لتحديد النمط الظاهري العضوي الشاذ. وتتمثل الخطوة النهائية في إنتاج الجيل الثالث من الطفرات وتأكيد وجود النمط الظاهري الطافر. وفي النهاية، يمكن تحديد موقع الطفرة المتنحية باستخدام أدوات تسلسل الجيل القادم.

بمجرد تحديد موقع الجين الطافر، يجب أن يؤدي التحول الجيني باستخدام الجين من النوع البري إلى استعادة النمط الظاهري العضوي الشاذ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالحفاظ على السلامة المورفولوجية والوظيفية لعضيات النبات. يؤدي العلاج بـ methanes sulfonate لبذور atop sta إلى تحفيز تغيرات في مثيلة السيتوزين في الجينوم، مما يؤدي إلى تحول السيتوزين من gwan إلى timing.

إضافة الطفرات. تعد المعالجة بـ EMS خطوة أساسية في هذا البروتوكول لضمان تحقيق نسبة طفرات مثالية داخل فردين من M. للبدء، احصل على بذور Arabidopsis من النمط البري Columbia Ecotype التي تم هندستها مسبقاً لحمل علامة فلورية ذات صلة بالعضيات.

انقل 0.8 جرام أو حوالي 40,000 بذرة إلى أنبوب فالكون سعة 50 ملليلتر. ثم أضف 25 ملليلتر من الماء المقطر و 0.2% من كبريتات الإيثيل ميثان السلفونات. قم بتحضين الخليط لمدة 16 ساعة في جهاز خلط للطفرات على سرعة منخفضة، وبعد التحضين، قم بشفط السائل والتخلص منه في دورق يحتوي على هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 مولار.

لتعطيل مادة EMS، أضف 25 milliliters من الماء إلى أنبوب Falcon الذي يحتوي على البذور. أغلق الأنبوب واقلبه خمس مرات لغسل البذور. بعد أن تستقر جميع البذور، اسحب الماء وتخلص منه في دورق هيدروكسيد الصوديوم بتركيز one molar.

كرر خطوة الغسيل هذه حتى 10 مرات، وبعد الغسلة الأخيرة، صَفِّ البذور باستخدام أقل كمية ممكنة من الماء. انتقل إلى تعقيم البذور بإضافة 25 milliliters من مبيض بتركيز 10% والرج بقوة لمدة 30 ثانية. وبمجرد استقرار البذور في القاع، صب المبيض واشطفها بـ 25 milliliters من الماء المعقم.

بعد إزالة الماء المعقم، أضف 25 milliliters من ethanol بتركيز 70%. رجّ الأنابيب لمدة 30 ثانية واترك البذور تستقر في القاع. اسكب ethanol ثم اشطف البذور باستخدام 25 milliliters من الماء المعقم.

كرر عملية الغسل بالماء المعقم مرتين. ثم صب البذور في طبق بتري بلاستيكي يحتوي على ورق ترشيح بسمك ثلاثة مم. اترك البذور لتجف تحت غطاء سحب الهواء بعد تحضين البذور لمدة يومين عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

ضع البذور في طبق بتري بقطر 150 مليمتر بمعدل يتراوح بين 250 و300 بذرة لكل طبق في نصف وسط Magi and scoog المحتوي على fighter gel كعامل هلامي. قم بزراعة بذور الجيل M1 على الأطباق لمدة أسبوعين. ثم انقل الشتلات إلى التربة واترك النباتات لتواصل نموها.

بعد مرور 30 إلى 45 يوماً، ستصل النباتات إلى مرحلة النضج حيث تظهر الثمار بوضوح. عند هذه النقطة، يتم جمع بذرتين M2 من كل نبات M1 منفرد لإنتاج 1000 سلالة M2 مستقلة. ومن أجل فحص الشتلات باستخدام مجهر بؤري أو مجهر فلوري، يتم إنماء 60 بذرة من كل سلالة M2 لمدة تتراوح بين سبعة إلى 10 أيام في أطباق بتري بلاستيكية في وسط نصف.

قم بزراعة خمس شتلات من مجموعة التحكم غير المعالجة بـ EMS على نفس الطبق في وسط Moreish و scoog الذي يحتوي على fighter gel. وبمجرد نمو الشتلات، قم بتثبيت من 5 إلى 10 من cos lead-ins بحيث يكون جانب ختم ABAC مواجهاً لعدسة 40x على شريحة مجهرية وتغطيتها بغطاء الشريحة. وتحت الفلورسنت، افحص كل olein من المنطقة القشرية إلى المنطقة المتوسطة لرصد أي تغير في التوزيع تحت الخلوي لعلامة العضية. بعد نقل النباتات الإيجابية إلى التربة وتنميتها كما هو موضح أعلاه، تأكد من أن النمط الظاهري الطافر موجود في الجيل M three.

قم بإزالة الطفرات الخلفية الملوثة من خلال التهجين الرجعي ثلاث مرات على الأقل مع جينوم من النوع البري يحتوي على الوسم الفلوري العضاني المطلوب كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء عملية الرسم الخرائطي، استخدم طقم cogen DN Easy Z plant mini لاستخلاص حوالي ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي من M three، والذي يمثل الحمض النووي لـ Columbia الطافر متماثل الزيجوت. قم بإرسال هذا الحمض النووي لإجراء تسلسل باستخدام Illumina genome analyzer two 14.

تتمثل الخطوة التالية في تهجين طفرة zago من صنف Colombia مع صنف Las Berger لإنتاج نسل F1 عن طريق التلقيح الذاتي، حيث يمكن أن يحدث هذا المزيج. سينتج عن ذلك جيل F2 الذي سيعمل في النهاية كمجتمع رسم خرائط يحتوي على الجين المستهدف المسبب للطفرة. ومن خلال مقارنة الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) لهذا المجتمع مع الحمض النووي الجينومي للنباتات البرية (wild type)، يمكن تحديد موقع الطفرة في الجينوم.

بعد نمو نباتات الجيل الثاني F2، اجمع ما بين 70 و100 فرد من نباتات F2 التي تظهر النمط الظاهري الشاذ، والعدد نفسه من نباتات F2 ذات النمط الظاهري البري، ثم اجمع قرصاً ورقياً من كل نبات باستخدام ثاقبة الورق. يجب جمع الأقراص الورقية من أوراق ذات عمر متماثل. ولضمان الحصول على كميات متساوية من DNA، يمكن معالجة العينات لاستخلاص الجينوم بشكل منفصل أو في مجموعات.

في هذه الحالة، من الممكن جمع خمس إلى 10 عينات لكل أنبوب eend orph بحيث يكون هناك عدد أقل من الأنابيب التي يجب استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي منها. استخدم مجموعة master pure plant leaf DNA purification kit لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي. يمكن بعد ذلك تقدير كمية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي الذي تم الحصول عليه من كل عينة باستخدام جهاز NanoDrop.

بعد ذلك، يتم دمج كميات متساوية من DNA من كل عينة وصولاً إلى إجمالي 300 nanograms، مع الحفاظ على عينات النوع الطافر والنوع البري منفصلة. لإجراء تفاعل الوسم أولاً، أضف 60 µL من محلول البادئ العشوائي (random primer) بتركيز 2.5 x و 42 µL من الماء. بعد تمييع DNA عند درجة حرارة تزيد عن 95 °C لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، ضع العينات على الثلج لتمييعه. أضف 15 µL من 10 X DN tps.

امزج مع biotin DCTP وأكمل الحجم بإضافة ثلاثة µL من Glen polymerase. ثم حضّن العينات طوال الليل عند 25 °C.

في اليوم التالي، أضف 15 µL من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 M و 400 µL من الإيثانول البارد بتركيز 100%. يتم تحضين العينات المخلوطة عند درجة حرارة -80 °C لمدة ساعة واحدة، ثم تُجرى عملية طرد مركزي بسرعة 20,500 ×g لمدة 15 دقيقة. تُغسل الراسبة باستخدام 500 µL من الإيثانول البارد بتركيز 75% بعد عملية طرد مركزي ثانية.

جفف كرات DNA عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الكرات في 100 µL من الماء واستخدم 5 µL للتحقق من الحصيلة والجودة باستخدام هلام bio. تم تحميل تفاعلات الوسم العشوائي الأولية على هلام agarose بنسبة 1% من تجمع لنباتات F2 من النوع البري ومن تجمع لنباتات F2 طافرة.

كخطوة نهائية، أضف 95 µL من تفاعل الوسم للنوع البري والطفرة من أجل تهجين مصفوفة جينوم arabidopsis ath one للرقاقة الجينية. وبعد مسح الماسح الضوئي، يتم تحليل ملفات dot CL الناتجة باستخدام برنامجنا. بعد تثبيت البرنامج، افتح التطبيق والصق سلسلة bioconductor الموجودة في الإجراء المكتوب.

ثم اضغط على مفتاح الإدخال (return)، وهو ما سيؤدي إلى تثبيت حزم BIOCONDUCTOR القياسية من موقع الويب الخاص بالمصفوفات والتنميط الجيني ورسم الخرائط. قم بتنزيل الملفات المدرجة في النص وفك ضغطها في مجلد جديد على سطح المكتب. احتفظ بالبيانات التي تم الحصول عليها من تجربة الشريحة الجينية في المجموعات: النوع البري C، وL، والطافر C. الآن قم بنسخ بيانات الشريحة الجينية للنوع البري C والطافر C إلى المجلد.

بعد ذلك، افتح برنامج R على جهاز الكمبيوتر الشخصي. انقر فوق "file" ثم انقر فوق "change directory". اختر المجلد الذي يحتوي على الملفات، وانقر فوق "file load workspace"، ثم اختر A one V five R data open read C do R باستخدام المفكرة (notepad) وانسخ النص كاملاً إلى R. بالنسبة لجهاز mac، انقر فوق "mis" ثم انقر فوق "change working directory".

اختر المجلد الذي يحتوي على الملفات. انقر فوق "workspace" ثم "load workspace file" واختر ATH one V five R data. وبالمثل، افتح كل من SFP R و MAP R باستخدام محرر النصوص (text edit) وانسخ النص إلى R في نافذة وحدة التحكم (console window).

ستظهر رسالة للبحث عن الجينات في مورد معلومات Arabidopsis أو TAIR. قم بنسخ الرابط الموجود في النص ولصقه في متصفح الإنترنت. ستظهر نافذة تطلب فتح الملف أو حفظه.

اختر حفظ. حدد اسم الملف وأضف الامتداد. قم بتنفيذ x ls.

ثم انقر على حفظ. يظهر هنا نتيجة نموذجية متوقعة. بعد تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من مصفوفة الجينوم Arabidopsis H one، يمثل هذا الشكل مثالاً على تعيين طفرة Columbia zero باستخدام رقاقة جينات Arabidopsis، وتهجين الجينوم A H one، حيث تمثل الأشرطة الأفقية عتبات الكشف.

تقع الطفرة في هذا المثال على الكروموسوم واحد، وهي محددة بأشرطة عمودية. افتح ملف dot XLS للعثور على إحداثيات الطفرة ضمن المنطقة المحددة. وفي قراءات Illumina المجمعة لجينوم الطفرة، حدد انتقالات EMS النوعية من بين تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة.

بمجرد إتقان هذا النهج، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لرسم خرائط جينية في إطار زمني قصير مقارنة بطريقة رسم الخرائط التقليدية.