باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا

يوضح هذا الفيديو إجراءً لتحديد الجينات التي تنظم نمو وحجم جسم ديدان *C. elegans*. باستخدام تداخل الحمض النووي الريبوزي أو RNAi لتعطيل الجينات المرشحة، يتم أولاً تحضير أطباق تحتوي على بكتيريا تعبر عن RNA مزدوج السلسلة يستهدف الجينات المعنية. ثم يتم نقل الخناث في المرحلة اليرقية الرابعة إلى أطباق RNAi.

بمجرد وصولها إلى مرحلة البلوغ المبكر، تُنقل إلى أطباق RNAI جديدة لوضع البيض. وبعد عدة ساعات، يتم إخراجها لترك مجموعات متزامنة من الأجنة. وعند مرحلة النمو المطلوبة، يتم جمع النسل وتثبيته على شرائح مجهرية.

وأخيراً، يتم الحصول على صور مجهرية للديدان. ويُظهر تحليل الصور تغيرات في حجم الجسم ناتجة عن تعطيل الجينات. وعلى الرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لتحديد منظمات مسار إشارات TGF beta، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على مسارات أخرى تنظم التطور ما بعد الجنيني في ديدان *C. elegans*، مثل مسار إشارات الإنسولين.

ابدأ هذا الإجراء باستنساخ تسلسلات الجينات المستهدفة في الناقل L 4 4 4 0 A، وهو بلازميد RNAi شائع الاستخدام في الديدان، ثم قم بتحويل البلازميد المأشوب إلى السلالة البكتيرية HT one 15 DE three. ازرع البكتيريا المحولة على أطباق أغار LB تحتوي على 25 micrograms per milliliter من الكربونيك و 12.5 micrograms per milliliter من التتراسيكلين، ثم اختر مستعمرة واحدة لاستخدامها مستقبلاً.

في هذه الأثناء، يتم تحويل الناقل الفارغ L 4 4 4 0 إلى السلالة البكتيرية HT one 15. لاستخدامه كمجموعة ضابطة للتجارب، تُزرع البكتيريا المحولة في 1 milliliter من مرق LB مع 100 µg/mL من الأمبيسيلين طوال الليل عند 37 °C.

لا يتم إضافة التتراسايكلين لأنه يقلل من كفاءة RNAI. أضف خمسة ملليلترات أخرى من مرق LB المحتوي على 100 ميكروجرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين إلى المزرعة التي تم تحضينها طوال الليل، ثم حضنها لمدة تتراوح بين أربع إلى ست ساعات أخرى عند 37 درجة مئوية. وبمجرد أن تصبح المزرعة جاهزة، يتم استزراع 0.5 ملليلتر من بكتيريا التجربة أو بكتيريا التحكم على أطباق ديدان RNAI الموسومة باسم المستنسخ المناسب.

يجب تحضير طبقين على الأقل لكل حالة. تُحضضن الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي.

يجب توفير طبقة بكتيرية تعبر عن RNAi سواء بوجود أو عدم وجود تسلسل الجين المستهدف. ستستخدم الحيوانات هذه البكتيريا كمصدر للغذاء. وبمجرد تجهيز أطباق تغذية RNAI، يتم تعقيم طرف سلك بلاتيني باستخدام اللهب.

بعد ذلك، استخدم سلك البلاتين لنقل ستة إلى عشرة من خنافس *C. elegans* الخنثى في المرحلة اليرقية الرابعة (L4) إلى كل طبق RNAi. اترك الخناثى تنمو عند درجة حرارة 20 degrees Celsius طوال الليل. وفي اليوم التالي، ستصبح الحيوانات في مرحلة البلوغ المبكر.

انقلهم إلى طبق RNAI جديد ومجهز ومسمى بشكل مناسب. قم بحضن الأطباق عند 20 degrees Celsius لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات للسماح للبالغين بوضع البيض. بعد انتهاء فترة الحضانة، قم بإزالة جميع الحشرات البالغة من الطبق لمزامنة الذرية.

بمجرد إزالة البالغين، ابدأ بحساب الوقت. هذا هو الوقت صفر. قم بتحضين الأطباق عند 20 درجة مئوية للسماح للحيوانات بالنمو حتى المرحلة التطورية المطلوبة.

هنا، سيتم اختيار البالغين الصغار لإجراء التحليل المظهري. بالنسبة لعمليات التثبيط الجيني (knockdowns) التي تتطور بمعدل طبيعي، يلزم تحضين لمدة 72 hour. ضع في اعتبارك أن الجينات المختلفة تؤثر على تطور الحيوانات بشكل متفاوت، لذا قد يتطلب الأمر تعديل فترات التحضين.

إذا تسبب تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في نمو الحيوانات بمعدل مختلف، يمكن تحديد البالغين الشباب بأنهم أولئك الذين لم يتجاوزوا 24 ساعة بعد المرحلة اليرقية الرابعة (L four)، مع اكتمال تطور الفتحة التناسلية (VUL) ووجود من اثنين إلى ستة أجنة في الرحم كما هو موضح هنا. ولتحديد مراحل النمو الأخرى، يجب على الباحث استخدام تطور الغدد التناسلية وتطور الفتحة التناسلية (VUL) كدليل. وبمجرد نمو الحيوانات إلى المرحلة المناسبة، يتم الاستعداد لتقييم الأنماط الظاهرية لحجم الجسم في الديدان المعالجة بتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi).

بعد ذلك، ضع طبقتين من شريط التسمية الملون على شريحة عينات زجاجية بسمك واحد مليمتر كما هو موضح هنا. قم بتجهيز شريحتين زجاجيتين بهذا الشكل. ثم ضع شريحة زجاجية جديدة بين الشريحتين اللتين يحتويان على الشريط، وأضف قطرة من 2%Agros المذاب في الماء.

اضغط بشريحة زجاجية ثانية فوق مركز الشريحة الزجاجية الجديدة لتشكيل وسادة agros رقيقة. وبمجرد أن تتصلب مادة agros، قم بإزالة الشريحة العلوية. وبذلك تصبح الشريحة التي تحتوي على وسادة agros جاهزة لتحميل الديدان.

ضع علامة على الشريحة باسم المستنسخ. أضف 10 µL من sodium azide بتركيز 25 mM إلى وسادة aros. ثم باستخدام سلك بلاتيني كما سبق، انقل من 30 إلى 40 حيواناً إلى محلول sodium azi.

لتثبيتها، ضع غطاء شريحة في الأعلى. كرر هذه الخطوة لكل من الحيوانات المعالجة بـ RNAi الحاملة لـ L 4 4 4 0 المؤتلف والفارغ. بعد ذلك، ضع شريحة الميكرومتر تحت المجهر التشريحي باستخدام عدسة شيئية بقوة 2.5 x.

باستخدام برنامج Q Capture أو برنامج مشابه، قم بالتقاط صورة لمسطرة الميكرومتر واحفظها. بعد ذلك، ضع الديدان تحت المجهر والتقط الصور. لقياس طول الجسم أولاً، افتح صورة مسطرة الميكرومتر في برنامج Image Pro.

بعد ذلك، انقر على measure واختر calibration. ثم اختر spatial Calibration wizard مع تحديد calibrate the active image. انقر على next.

أدخل اسم عملية المعايرة وتأكد من ضبط وحدات المرجع المكاني على الميكرونات. ثم حدد مربع "Create a reference calibration" وانقر على "Next". انقر على "draw reference line".

سيظهر شريط مقياس مرجعي. قم بإعادة تحديد موضع شريط المقياس ليتطابق مع طرفي الميكرومتر. ثم حدد أن المرجع يشير إلى 1000 وحدة.

انقر على موافق، ثم التالي، ثم إنهاء. وبمجرد معايرة البرنامج، افتح صورة دودة.

بعد ذلك، من قائمة measure (القياس)، اختر calibration (المعايرة)، ثم انقر فوق select spatial (تحديد مكاني). من القائمة المنسدلة، اختر اسم الملف الذي تم إنشاؤه لمعايرة الميكرومتر. ثم من قائمة measure (القياس)، اختر measurements (القياسات) في النافذة التي تظهر.

اختر أداة الرسم الحر، وباستخدام فأرة الكمبيوتر، ارسم خطاً يمر عبر مركز جسم الحيوان من الرأس إلى الذيل. سيظهر الطول في النافذة. كرر هذه العملية لجميع الحيوانات الموجودة في المجال.

قم بتصدير قياسات الطول إلى ملف Microsoft Excel أو أي برنامج إحصائي آخر مناسب. حلل البيانات عن طريق حساب المتوسط الحسابي والانحراف المعياري لكل عينة. ثم قارن النتائج لكل مجموعة باستخدام اختبار T لـ student.

يعد البروتين DBL one، وهو من عائلة البروتينات الفائقة لعامل النمو التحويلي بيتا (TGF beta SUPERFAMILY)، ضرورياً لتنشيط مسار TGF beta. واستجابةً لتنشيط الإشارة، تنتقل محولات إشارة smad داخل الخلايا إلى النواة وتبدأ عملية نسخ الجينات. ويلاحظ أن الكائنات التي تعاني من خلل في مسار TGF beta تكون ذات حجم جسم أصغر، بما في ذلك طول جسم أقصر مقارنة بالحيوانات البرية (wild type).

وبالتالي، يتم إجراء مسوحات لـ sea elegance. وتُستخدم طفرات حجم الجسم لتحديد مكونات ومعدِّلات مسار إشارات TGF beta لاختبار فعالية RNAi عن طريق التغذية من أجل تحديد طفرات حجم الجسم. وقد استُخدم RNAi لتثبيط مكونات مسار DBL وهي SMA three و SMA six في أربع سلالات مختلفة من sea elegance.

شملت سلالات C elegans التي تم اختبارها سلالتين شديدتي الحساسية لـ RNAi وهما A one وLin 15 B وRF three، بالإضافة إلى السلالة البرية القياسية N two وسلالة LIN 36، التي تماثل حساسيتها لـ RNAi سلالة N two كما هو موضح هنا. وعندما تم تعطيل تعبير SMA three أو SMA six، أظهرت الحيوانات حجماً جسدياً أقصر بشكل ملحوظ من حيوانات المجموعة الضابطة، باستثناء حالة RNAi لـ SMA six في سلالة Lin 36. الخلفية في RF three.

كانت أطوال أجسام البالغين الصغار في المجموعة الضابطة بعد معالجة RNAi تتراوح بين 84 إلى 95% من مجموعة الناقل وحده. وفي سلالة A one Lin 15 B، تراوحت أطوال أجسام البالغين الصغار بعد معالجة RNAi بين 68 إلى 86% من الحيوانات الضابطة. ومع ذلك، فإن سلالة A one lin 15 B تنتج ذرية أقل.

وهذا يجعلها غير مناسبة للمسح على نطاق واسع. لذا، يُقترح استخدام سلالة RF three لهذه التقنيات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الجينات التي تنظم النمو وحجم الجسم باستخدام تقنية تداخل RNI.