كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمييز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى عصبونات حركية. أولاً، يتم استزراع الخلايا الجذعية الجنينية للفأر على أرومات ليفية جنينية أولية للفأر، مع الإضافة التكميلية لعامل تثبيط لويكيميا. بعد ذلك، يتم تعزيز عملية التكوين العصبي بإضافة noggin وBFGF وFGF8، ثم يتم تحفيز تخصيص العصبونات الحركية عن طريق الحضن مع حمض الريتينويك ومحفز smoothened، ويلي ذلك استطالة المحاور العصبية ونضوج العصبونات الحركية.

أخيراً، استخدم مجهر التألق المناعي لفحص خلايا MES المتمايزة التي تُظهر تألقاً قوياً لبروتين GFP. إن توليد كميات كبيرة من الخلايا العصبية الحركية قد سهّل البحث في أمراض الخلايا العصبية الحركية مقارنة بالبروتوكولات الحالية المتاحة. وتعد هذه الطريقة في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى خلايا عصبية حركية أكثر كفاءة، كما يمكن أن توفر هذه المنهجية رؤىً حول الضمور العضلي الشوكي.

يمكن تطبيق ذلك أيضاً على أمراض العصبونات الحركية الأخرى مثل التصلب الجانبي الضموري. لزراعة أرومات ليفية جنينية أولية للفئران، قم بتغطية أربعة أطباق زراعة أنسجة بقطر 100 مليمتر بثمانية مليلترات من محلول الجيلاتين بتركيز 0.1%. بعد مرور 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تخلص من السائل الزائد. الآن، قم بتخفيف عبوة واحدة من mitomycin C في PMEF المنشط ضمن 40 مليلتر من وسط PMEF، ثم وزعها على الأطباق الأربعة واتركها للنمو لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

بعد ذلك، يتم إذابة أنبوب واحد من خلايا MES في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. تُغسل الخلايا باستخدام 5 mL من وسط E ES في أنبوب سعة 15 mL، ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 800 RPM لمدة خمس دقائق.

قم بشفط السائل الطافي وأعد تعليق خلايا MES في 20 milliliters من أوساط ES مع إضافة عامل تثبيط اللوكيميا الطازج. باشر بإزالة 10 milliliters من الأوساط من مستنبتات PMEF واستبدلها بـ 10 milliliters من تعليق خلايا HBG three ES. راقب تطور خلايا MES بمرور الوقت من مستعمرات صغيرة عند 24 ساعة إلى مستعمرات يبلغ قطرها حوالي 100 micrometers عند 72 ساعة بعد الزراعة.

استبدل الوسط الغذائي يومياً للحفاظ على تكاثر الخلايا من أجل تحفيز خلايا MES. التمايز إلى عصبونات حركية. يجب أولاً فصل الخلايا الجذعية الجنينية للفأر عن خلايا التغذية PMEF، ثم استزراعها في بيئة تعليق في يوم التحفيز.

لكل مزرعة ES بحجم 100 مليمتر، جهز دورق T25 مطلياً بـ 0.1% gelatin. بعد مرور 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أزل الـ gelatin الزائد واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS. استمر في سحب الوسط من مزرعة ES بعناية، مع التأكد من عدم تحريك المستعمرات الملتصقة بشكل ضعيف. ثم اغسل مرة واحدة باستخدام 10 milliliters من PBS.

لفصل خلايا MES عن خلايا PMEF، أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25%trypsin EDTA واتركها للحضن لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. عند 37 درجة مئوية، تحقق من انفصال الخلايا الجذعية وخلايا PMEF عن الطبق. ثم أضف 15 ملليلتر من وسط ES الطازج وقم بتفتيت المستعمرات عن طريق السحب بالماصة.

انقل معلق الخلايا إلى دورق T one 50 المجهز بطلاء الجيلاتين، ثم حضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 °C للسماح لخلايا PFS بالالتصاق بالسطح المطلي بالجيلاتين. الآن، قم بحصد خلايا MES العائمة في أنبوب سعة 50 mL وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في 10 mL من وسط التمايز العصبي.

يتم عدّ الوسط باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم يتم الزرع في طبق زراعة معلق بمقاس 100 مليمتر عند التمايز. في اليوم الأول، يتم التحقق مجهرياً من أن خلايا MES قد شكلت تجمعات عائمة صغيرة تسمى الأجسام الجنينية. وبما أن أي خلايا PMEF منقولة قد تلتصق بالطبق، يتم نقل خلايا ES المعلقة والوسط إلى أنبوب سعة 15 مليمتر، ثم يتم إجراء الطرد المركزي بسرعة 500 RPM لمدة ثلاث دقائق.

لحصاد الأجسام الجنينية، قم بشفط الوسط بعناية، ثم أضف 10 milliliters من وسط تمايز عصبي جديد إلى الأجسام الجنينية المترسبة، وبعد ذلك قم بزراعة الخلايا في طبق زراعة بكتيري جديد لمدة 24 ساعة في مرحلة التمايز. في اليوم الثاني، قم بتدوير طبق الزراعة وانقل الوسط والأجسام الجنينية إلى أنبوب سعة 15 milliliter. اترك الأجسام الجنينية تترسب بفعل الجاذبية، ثم اشفط الوسط بعناية وأعد تعليق الأجسام الجنينية في 10 milliliters من وسط تمايز العصبونات الحركية.

يتم استزراع أجسام شبيهة بالأجسام الجنينية (EBS) في طبق بكتيري جديد لمدة خمسة أيام أثناء التمايز. وفي اليوم السابع، يتم التحقق من أن قطر الـ EBS يتراوح تقريبًا بين 150 إلى 200 micrometers وتظهر إشارات GFP قوية عند التمايز. وفي اليوم الخامس، أي قبل يومين من تفكيك الـ EBS، توضع شرائح تغطية دائرية بقطر 12 millimeter في قاع طبق يحتوي على 24 بئرًا.

ثم أضف 0.5 milliliters من poly DL ornithine بتركيز 100 micrograms per milliliter، واحضنها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. اشفط poly DL ornithine وجفف الأطباق والشرائح الغطائية بالهواء داخل غطاء زراعة الأنسجة. اشطف آبار الأطباق بماء مقطر مزدوج ثلاث مرات.

اترك الشرائح الزجاجية لتجف في الهواء من أجل تغطيتها. قم بإعداد تخفيف حديث من لامينين الفأر بتركيز 2 µg/mL في 5 mL من 1X PBS مبرد. أضف 0.5 mL لكل بئر واحضنها عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

اغسل مرتين باستخدام PBS عند التمايز. في اليوم السابع، اجمع EBS في أنبوب سعة 15 milliliter واترك EBS يترسب بفعل الجاذبية. بعد أربع غسلات باستخدام PBS، أضف 1 milliliter من ACU max إلى EBS وامزجه برفق ثم حضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، بعد ذلك اسحب فائض ACU max الذي يغطي EBS.

أضف الآن 3 mL من وسط MND وقم بتفكيك EBS عن طريق السحب والضخ بالماصة (pipetting) حوالي 20 مرة باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 mL، ثم حضن الخليط لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ومرر معلق الخلايا عبر مصفاة الخلايا (cell strainer cap) إلى أنبوب بحجم 12 × 75 mm. كرر خطوة التفكيك هذه مع التكتلات والخلايا المتبقية في المصفاة لزيادة حصيلة الخلايا المفردة في معلق نهائي من الخلايا المفردة بحجم 6 mL. اخلط معلق الخلايا المفردة بلطف وقم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم خفف الخلايا في وسط MND كامل لتصل إلى كثافة 2 × 10⁵ خلية/mL قبل الزراعة في الأطباق.

0.5 ملليلتر من معلق الخلايا لكل بئر من أطباق الـ 24 بئراً المجهزة والتي تحتوي على شرائح تغطية مطلية بـ poly DL ornithine laminin. تمد الخلايا المتمايزة استطالات عصبية طويلة بعد يومين. في المزرعة، يمثل HBG three خط خلايا ES مشتق من فأر معدل وراثياً يعبر عن EGFP تحت تحكم المروج HB nine النوعي للعصبونات الحركية مع بروتوكول تمايز محدد.

يمكن استخدام خلايا MES لاشتقاق العصبونات الحركية. تشكل خلايا MES غير المتمايزة مستعمرات مستديرة فوق طبقة مغذية من الخلايا الليفية. وتتميز هذه الخلايا بتعبير ضعيف لبروتين GFP.

فُصلت خلايا MES هذه عن الطبقات المغذية وزُرعت في أطباق منخفضة الالتصاق لتكوين أجسام جنينية. وأظهرت خلايا MES المتمايزة تألقاً قوياً لبروتين GFP بعد اليوم السابع. ثم فُككت أجسام EBS المتمايزة وزُرعت في أطباق مغلفة بـ poly DL ornithine laminin.

تمتد الزوائد العصبية الطويلة من أجسام الخلايا المزرعة بعد يومين من الزرع للخلايا المتمايزة، ويمكن توصيف العصبونات الحركية المشتقة من خلايا MES عن طريق التلوين المناعي الفلوري. تعبر هذه الخلايا الموجبة لـ GFP عن واسم العصبونات الشامل neurofilament وواسمين محددين للعصبونات الحركية، وهما Eyelid one و choline acetyl transferase، بينما يصبغ DPI النوى مجتمعة.

يوفر بروتوكول التمايز المكون من خطوتين طريقة فعالة لتمايز خلايا MES إلى عصبونات حركية شوكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران بكفاءة إلى عصبونات حركية. وفي الختام، تذكر أن الجودة العالية للخلايا الجذعية الجنينية للفئران هي المعيار الأكثر أهمية لتوليد العصبونات الحركية بكفاءة.