الهندسة وتطور فيروس الغدة اسوشيتد الاصطناعية (AAV) المتجهات العلاج الجيني عن طريق الحمض النووي العائلة الخلط

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء مكتبة متنوعة للغاية من قفيصات الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) الاصطناعية، والتي يمكن من خلالها اختيار جسيمات ذات خاصية محددة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تكسير جينات قفيصة AAV المستنسخة والمختارة عبر هضم محكوم بإنزيمات القطع (DNase I) للسماح بإعادة تجميعها لاحقاً في تتابعات خيمرية من خلال تفاعلين للـ PCR. وكخطوة ثانية، يتم استنساخ ناتج الـ PCR الناتج مرة أخرى في بناء AAV قادر على التضاعف لإنتاج مكتبة بلازميدية تضم مليون جين قفيصة AAV مختلف على الأقل.

بعد ذلك، يتم ترانسفكشن مكتبة البلازميد هذه في خلايا 2 9 3 T، بالتزامن مع بلازميد مساعد للفيروس الغدي لإنتاج مكتبة فيروسات خيمرية يمكن اختيارها لاحقاً على الخلايا المستهدفة أو في الحيوانات. وتظهر النتائج نجاح الهندسة الجزيئية وتطور ناقلات A A V تخليقية جديدة بناءً على تعبير جيني للمراسل يكون أكثر تعزيزاً أو تخصصاً في الخلايا المستنبتة أو في الفئران البالغة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل عرض الببتيد في أن إعادة خلط عائلات DNA تملك القدرة على تغيير وتحسين ميزات متعددة لغلاف AV في آن واحد، بدءاً من الارتباط بالخلية والنقل داخل الخلايا وصولاً إلى إزالة الغلاف والتعبير الجيني في النواة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات العلاج الجيني وعلم الفيروسات، مثل كيفية الحصول على ناقل مثالي لتطبيق علاجي معين، أو كيفية تحليل نطاقات القفيصة الفيروسية المسؤولة عن خاصية محددة. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك العدوى بمسببات الأمراض الفيروسية، لأن طريقتنا تسمح بالتطور الجزيئي لناقلات A V التي تصيب الخلايا المستهدفة الفيروسية بشكل محدد وقوي، مثل الخلايا T لفيروس HIV أو الخلايا الكبدية لفيروسات التهاب الكبد. وعلى الرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة في بيولوجيا A V ويمكن استخدامها لتحسين ناقلات AV المستخدمة في العلاج الجيني.

يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة أيضاً على عائلات جينية أخرى ذات صلة أساسية أو تطبيقية، مثل الجينات المشفرة للفلورة، أو ثلاثة مراسلين، أو الإنزيمات الخلوية، أو البروتينات المشاركة في تداخل RNA. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول العثور على ناقل جيد لنقل الجينات العلاجية إلى شرائح من الفئران البالغة، وأدركنا أن جميع الأنماط المصلية لـ AV الموجودة طبيعياً تعاني من عيوب، مثل انتشارها العالي بين البشر، وبالتالي، ارتفاع معدل استجابة المناعة أو ضعف الأداء in vivo رغم كفاءة ترنسدكشن الخلايا الكبدية in vitro. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن تفتيت جين caps لـ AV القائم على DNA وبعض خطوات إنتاج المكتبة الفيروسية يصعب تعلمها لأنها تتطلب خبرة ووعياً بالمراحل الحرجة، وذلك لتسهيل التحضير الروتيني لكميات كافية من مختلف جينات القفيصة للفيروسات المرتبطة بالغدد.

من أجل إجراء إعادة خلط الحمض النووي (DNA shuffling)، يتم أولاً استنساخ هذه الجينات في هيكل بلازميد مشترك. ولتحقيق ذلك، يتم تضخيم جينات القفيصة (cap genes) المطلوبة أولاً بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من بلازميدات AAV المتوفرة شائعة الاستخدام باستخدام البادئين cap F وcap R. بعد ذلك، يتم استنساخ جينات القفيصة في بلازميد مُهندس ليحتوي على مواقع ارتباط محددة للبادئات بالإضافة إلى مواقع قطع إنزيمية. في هذا المثال، يتم استنساخ جين القفيصة في موقعي PAC one وASC one، واللذين يتواجدان في البادئات المستخدمة لتضخيم القفيصة وفي البلازميد المستقبل، ولكنهما غائبان في معظم AAVs. عند تكوين مجموعات البلازميدات التي تشفر جينات قفيصة AAV، تبدأ عملية إعادة خلط القفيصة عن طريق تفاعل PCR، وذلك بتضخيم جينات القفيصة المختارة باستخدام البادئين T3 وT7.

قم بإعداد تفاعل PCR بحجم 50 µL يحتوي على 200 ng من بلازميد cap، وبتركيز نهائي 2 µM لكل بادئ، و10 µL من منظم high five buffer بتركيز 5x، و1 µL من إنزيم high five polymerase. سينتج عن هذا التفاعل حوالي 3 µg من ناتج PCR، وهي كمية تكفي لما يصل إلى ستة تفاعلات خلط (shuffling reactions) بناءً على عدد جينات cap التي سيتم تضمينها في المكتبة. ابدأ بخمس دقائق عند 95 °C، ثم قم بتشغيل 40 دورة تتكون من 15 ثانية عند 94 °C، و30 ثانية عند 57 °C، وثلاث دقائق عند 68 °C، تليها خطوة نهائية لمدة 10 دقائق عند 72 °C.

بعد تنقية نواتج PCR، يتم استخدام هضم DNA متحكم به لإنشاء شظايا جين cap لإعادة تجميعها في Kyra. أحد أصعب جوانب هذا الإجراء هو الحصول على نطاق مفيد ومحدد من شظايا DNA المهضومة لجين cap لإعادة تجميعها في kyras؛ وتحقيقاً لهذا الهدف، نقوم بتجهيز كميات PLE من جينات cap المنقاة كبداية، ثم نعد تفاعلات متوازية متعددة بظروف متنوعة. لإعداد عملية الهضم بالتساوي، اخلط نواتج PCR المختلفة لجين cap لتصل الكمية الإجمالية إلى 4 µg في 54 µL من الماء، ثم أضف 6 µL من محول تفاعل DS و0.5 µL من DNAs 1 إلى التفاعل، ورج الأنبوب بعناية ثلاث مرات، ثم قم بطرد مركزي سريع وضعه فوراً على قالب تسخين بدرجة حرارة 25 °C.

قم بتحضين هذا التفاعل الأول لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتحضير تفاعل هضم ثانٍ، ولكن يتم تحضينه عند 25 degrees Celsius لمدة دقيقة واحدة و15 ثانية. وبهذه الطريقة، يتم إعداد تفاعلات متوازية متعددة بفترات تحضين تتراوح بين دقيقة ودقيقتين، مع تغيير وقت التحضين بزيادات قدرها 15 ثانية.

أوقف كل تفاعل بإضافة 6 µL من EDTA بتركيز 25 mM. قم برج الأنبوب بإيجاز باستخدام جهاز vortex والتحضين لمدة 10 دقائق عند 75 °C. ستؤدي التفاعلات المتوازية المتعددة إلى الحصول على خمس عينات من القبعات المهضومة باستخدام DNAs، واحدة لكل فترة تحضين متغيرة، ثم قم بتنقية شظايا القبعات على هلام AROS بتركيز 1% قياسي.

من الناحية المثالية، يجب أن يظهر لطخة (smear) تتراوح بين 100 و 500 زوج قاعدي كما هو موضح في هذا المثال، مع بدء تجربة أوقات تحضين تبلغ دقيقة واحدة، أو 45 ثانية، أو دقيقتين. في عملية DNA family shuffling، يتم أولاً إعادة تجميع شظايا الـ cap إلى تتابعات كاملة الطول عبر تفاعل PCR، حيث تقوم هذه الشظايا ببدء التضاعف ذاتياً بناءً على التشابهات الجزئية. قم بإعداد تفاعل بحجم 50 µL يحتوي على 500 ng من الشظايا المنقاة، و 10 µL من fusion buffer بتركيز 10x، و 1 µL من dNTPs بتركيز 10 mM، و 1.5 µL من DMSO، و 0.5 µL من fusion.

يتم تحضين إنزيم البوليميراز لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، ثم يتم إجراء 40 دورة تتكون من 10 ثوانٍ عند 98 درجة مئوية، و30 ثانية عند 42 درجة مئوية، و45 ثانية عند 72 درجة مئوية، تليها خطوة نهائية لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تضخيم جينات القبعة (cap genes) المعاد تجميعها لغرض الاستنساخ اللاحق بواسطة تفاعل PCR ثانٍ باستخدام بادئات ترتبط بالتسلسلات الجانبية المحفوظة. على سبيل المثال، يتم تجهيز تفاعل بحجم 50 µL باستخدام SAF وSAR أو CUF وCUR، بحيث يحتوي التفاعل على 2 µL من ناتج تفاعل PCR الأول، وبتركيز نهائي قدره 2 µM لكل بادئة، و0.5 µL من magnesium chloride، و10 µL من 5x high-Fi buffer، و1 µL من high-Fi polymerase.

يُنصح بإجراء من 16 إلى 24 تفاعلاً لسلسلة البوليميراز المتسلسلة (PCR) لضمان الحصول على عوائد عالية كافية لعملية الاستنساخ اللاحقة. بعد تجميع نواتج الـ PCR وتنقية حزمة الـ cap كاملة الطول، تتمثل الخطوة التالية في هضم مجمع جينات الـ cap المنقاة باستخدام PAC one و SC one لاستنساخها في بلازميد AAV قادر على التضاعف. يحمل البلازميد المستقبل تكرارات طرفية معكوسة لـ AAV تحيط بجين AAV2 rep تحت تحكم محفز AAV P5، وPAC one وASC one.

تسمح مواقع القطع في اتجاه المصب من rep بالاستنساخ ضمن الإطار لمجموعة من cap المبعثرة. وتعتبر مواقع ارتباط بادئ LSE المشار إليها بالأسهم مفيدة لتسلسل جين cap، حيث يتم دمج شظايا cap والعمود الفقري للبلازميد المستقبل المقطوع بشكل مناسب بنسبة مولارية تبلغ ثلاثة إلى واحد. قم بتحضير خليط رئيسي بحجم إجمالي 40 microliter يكفي لـ 20 عملية تحول بتركيز نهائي للحمض النووي يبلغ 15 nanograms per microliter.

يُحضّن المزيج طوال الليل عند 16 درجة Celsius، وفي اليوم التالي، يتم تحويل تفاعل الربط إلى بكتيريا e coli. اخلط 2 µL من تفاعل الربط مع 30 µL من بكتيريا e coli الكهرومؤهلة، ثم انقل المزيج إلى كوفيتات التثقيب الكهربائي المبردة مسبقاً على الثلج، وقم بالتثقيب الكهربائي عند 1.8 kV و 200 ohms و 25 µF. يجب أن يكون ثابت الوقت قريباً من 5 ms، ثم أضف فوراً 1 mL من وسط SOC المسخن مسبقاً وانقله إلى دورق سعة 250 mL.

سوف ينتج عن إجراء 20 عملية صعق كهربائي (electroporation) كهذه مكتبة تتنوع بنحو 1 × 10⁶ من المستنسخات المختلفة. أضف حجماً واحداً من وسط SOC الذي تم تدفئته مسبقاً إلى عمليات التحول المجمعة، ورجّ المزيج عند درجة حرارة 37 °C وبسرعة 180 RPM لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف 40 milliliters من عمليات التحول المجمعة إلى 800 milliliters من وسط lb المضاف إليه الأمبيسيلين (ampicillin)، واحضن المزيج لمدة 16 ساعة أخرى تحت نفس الظروف، ثم يتم تنقية الحمض النووي البلازميدي (plasma DNA) للمكتبة باستخدام طقم تنقية متاح تجارياً.

تبدأ عملية إنتاج المكتبة الفيروسية بنقل مكتبة a av إلى خلايا HEC 2 9 3 T؛ لبدء هذا الإجراء، يتم استزراع خلايا HEC 2 9 3 T في 10 أطباق مربعة بمساحة 15 سنتيمتر مربع وتنميتها لمدة 48 ساعة عند 37 °C. لكل عملية نقل، يتم تحضير خليطين من الكواشف التاليين في أنبوبين منفصلين. الكميات التالية معطاة لكل 10 أطباق في الأنبوب الأول.

املأ 7.9 milliliters من كلوريد الصوديوم وDNA، ثم أضف الماء حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 15.8 milliliters. وفي الأنبوب الثاني، أضف 3.52 milliliters من البولي إيثيلين أمين، و7.9 milliliters من كلوريد الصوديوم، و4.38 milliliters من الماء. اخلط المزيجين معاً باستخدام جهاز الفورتكس، ثم حضنهما لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووزع المحلول بالتساوي على كل طبق من خلايا 2 9 3 T. يتم التحضين عند 37 degrees Celsius.

بعد مرور 48 ساعة، يمكن حصاد المكتبة الفيروسية. يتم كشط الخلايا في الوسط، وتجميع الخلايا من جميع الأطباق في أنبوب واحد، ثم إجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 1200 RPM لمدة 15 دقيقة. تُعلق كتلة الخلايا المترسبة في ستة ملليلترات من منظم تحليل الخلايا (lysis buffer)، ثم تُخضع لخمس دورات من التجميد والإذابة. وبعد انتهاء دورات التجميد والإذابة الخمس، تُحضن العينة مع Ben Nase لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

بعد ذلك، قم بطرد بقايا الخلايا بالتدوير بسرعة 3,750 RPM لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد تدرج للتنقية عن طريق استخدام ماصة باست لإضافة خمسة مليلترات من معلق الفيروس في أنبوب طرد مركزي من نوع Beckman Quicks seal، يليه 1.5 مليلتر من كل من محلول idal بتركيز 15% و25% و40%. أكمل تدرج السوائل باستخدام محلول التحلل (lysis buffer)، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي الفائق بسرعة 50,000 K لمدة ساعتين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

عند الانتهاء من عملية الطرد المركزي الفائق، أخرج الأنبوب من الدوار ونظف الجزء الخارجي من الأنبوب باستخدام 70%ethanol. اغرز إبرة في الجزء العلوي من الأنبوب للتهوية، واستخدم إبرة أخرى لسحب 1.2 milliliters من جزء 40%IOL. احرص على تجنب السحب من جزء 25% لأنه يحتوي على فراغات.

قفيصات A a v. يتم تحليل المستنسخات الفردية من مكتبة البلازميد الأصلية للتحقق من وظائفها وتنوعها من خلال استخدامها لإنتاج ناقلات A a v مأشوبة تعبّر عن جين مراسل، ثم تُعدى الخلايا المستزرعة أو الحيوانات بكميات مختلفة من الفيروس المنقى وتُحدد كفاءة ترصيص الجينات.

تظهر هنا نتائج المجهر الفلوري لثلاثة خطوط خلوية بشرية مصابة بخمسة نواقل AAV مختلفة تعيد تركيب البروتين الفلوري الأصفر (YFP) ومصنعة باستخدام جينات cap مُعاد ترتيبها. وتعد القياسات القائمة على تقنية FACS للتعبير عن الجين المراسل الفلوري طريقة بديلة لتحليل كفاءة التناقل. يوضح هذا الشكل نتيجة نموذجية لأربعة أنواع من الخلايا: خلايا الكلى البشرية، وعنق الرحم البشري، والأرومات الليفية الفأرية، والخلايا التائية البشرية، المصابة بـ 18 ناقلاً AAV مختلفاً تعيد تركيب YFP ومصنعة باستخدام جينات cap مُعاد ترتيبها تم اختيارها عشوائياً من مكتبة أصلية.

تم ترميز تعبير YFP بالألوان لتسهيل الرؤية. توضح الصور الموضحة نسب الخلايا المنقولة، حيث يشير اللون الأسود إلى 0% ويشير اللون الأبيض إلى أعلى عدد تم قياسه في كل نوع من الخلايا؛ ويمثل Clone B2 الأحمر مثالاً لمستنسخ ذو فعالية عامة ضعيفة، وهو أمر متوقع من القفيصات غير المختارة. يمكن بعد ذلك فحص المكتبة الفيروسية للبحث عن جسيمات منفردة تظهر معظم أو جميع الخصائص المطلوبة في خط خلوي معين أو في الحيوانات لأغراض الاختيار.

في الخلايا المستزرعة، يتم أولاً إصابة الخلايا بالعدوى المشتركة باستخدام حصص مختلفة من المكتبة وفيروس ENO five لدعم نمو a a v، ثم يتم حصاد الخلايا واستخلاص a a v المضخم واستخدامه لإعادة إصابة خلايا جديدة. يعد تحديد نسب adenovirus المثلى لـ a a v من أجل الإصابة المشتركة للخلايا أمراً هاماً، ومن المقاييس الجيدة لعدوى arius القوية هو ظهور التأثيرات المرضية الخلوية بعد ثلاثة أيام من تلقيح الفيروس، وهو ما يستدل عليه من خلال تدوير الخلايا وانفصالها؛ وفي هذا الشكل، تعرض اللوحة العلوية اليسرى خلايا غير مصابة، بينما تعرض اللوحات الأخرى خلايا مصابة بالكميات المحددة من adenovirus مقاسة بعدد الجسيمات لكل خلية. وهناك مؤشر آخر مفيد لإصابة a a v وتضخيمه وهو الكشف عن بروتينات القفيصة عن طريق لطخة ويسترن باستخدام الجسم المضاد B one الذي يتعرف على حاتمة قفيصة a a v محفوظة للغاية.

تظهر اللطخة الموجودة على اليسار خلايا مصابة مشتركة بأحجام مختلفة بالميكرولتر من مكتبة a a V وفيروس ENO المساعد. تمثل المساران الأولان أمثلة جيدة للظروف التي تعطي تعبيراً بروتينياً لـ a a v بالكاد يمكن اكتشافه، مما يشير إلى عدوى وتضخيم لـ a a v كافيين ولكن غير مفرطين، وبالتالي تحقيق الارتباط الوثيق المطلوب بين النمط الجيني والنمط الظاهري. وبناءً على ذلك، تم استخدام 0.11 أو 10 microliters من هذه الرواشح لإعادة إصابة خلايا جديدة.

تظهر نتائج تحليل اللطخة الغربية (western blot) في الخلايا الموجودة على اليمين. وفي LA c تم الإصابة بـ a v وحده كضابط سلبي. ومن الضروري أيضاً مراقبة تنوع المكتبة خلال جولات الإصابة المتكررة عن طريق تسلسل DNA.

يوضح هذا المخطط مقارنات لتسلسلات البروتين لمستنسخات AAV من مكتبة قائمة على AAV two وeight وnine قبل وبعد الانتقاء؛ تظهر التسلسلات الموجودة فوق الخط الأحمر نسخ AAV الأبوية. وتشير الأسهم الأرجوانية إلى أحداث إعادة التركيب المتماثل. ويحدد السهم الأحمر نقطة عبور بين AAV two وAAV nine لوحظت في جميع المستنسخات المختارة. ولغرض الانتقاء في الحيوانات، يتم حقن مكتبة AAV في الحيوانات، ثم تُستخلص من الخلايا أو الأنسجة المستهدفة بواسطة PCR، وبعد ذلك يتم استنساخها وإعادة تعبئتها لجولة عدوى جديدة.

يظهر هنا مثال على استعادة النسخ المتماثلة (clones) المصابة بنجاح من أكباد الفئران بعد أسبوع واحد من حقن المكتبة الطرفية. يوضح المسار الأول الحزمة المتوقعة بحجم 2.2 kilobase بينما يمثل المسار الثاني ضابطاً خالياً من القالب. أحجام حزم علامات DNA في المسار M موضحة بـ kilobases. وبغض النظر عن إجراء الاختيار، يجب في النهاية التحقق من صحة متغيرات القفيصة المثرية في الأنظمة المناسبة.

يظهر هنا مثال على الأداء المتفوق لـ a a V kymera مُحسَّن في الخلايا المستزرعة. تشير الألوان الداكنة إلى قدرة أعلى على العدوى لكل عدد من الجسيمات، وبالتالي لكل استنساخ. يتفوق A-A-V-D-J على مجموعة مكونة من ثمانية أنواع برية طبيعية من a a v في مجموعة واسعة من الخطوط الخلوية.

أخيرًا، يظهر تحليل لـ AAV KYMERA مختار في كبد الفأر. تم اختيار AAV DN على خلايا hepatoma مرآتية، ثم استُخدم لإنتاج ناقلات مؤشبة تعبر عن lucid brace، كما هو موضح في الفئران الممثلة (ثلاثة لكل مجموعة) بعد أسبوع واحد من التسريب الطرفي لجرعات متساوية من هذا الناقل أو ضابط يعتمد على AAV8 من النوع البري، وهو أحد أقوى العزلات الطبيعية المعروفة في كبد الفأر. يلاحظ أنه بينما يعطي مستنبت AAV DN تعبيرًا إجماليًا أقل قليلاً في الكبد، إلا أنه أكثر تخصصًا لهذا العضو، حيث يُظهر استهدافًا أقل بكثير للأنسجة غير الكبدية بمجرد ضبط مستويات التعبير الكبدي عبر برنامج التصوير بعد المعالجة.

يمكن إنجاز هذه التقنية في غضون أسبوع واحد، بدءاً من تضخيم جينات قفيصة AV وانتهاءً بالمكتبة الفيروسية، وذلك في حال تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر أن البروتوكول المقدم هنا مستمد من تجاربنا في اختيار الأنماط المصلية الطبيعية لـ AV، ومن المحتمل جداً أن تحتاج بعض الظروف إلى التعديل والضبط الدقيق عندما يقوم مستخدمون آخرون بإنشاء مكتباتهم المخصصة. وبالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عرض الببتيد الموجه للموقع باستخدام AGENESIS أو العشوائية المعتمدة على PCR لإنشاء مكتبات عالية التنوع أو لمحاولة تحسين خصائص القفيصات التي تم إنشاؤها وإثراؤها باستخدام تبديل عائلات DNA بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال نقل الجينات الفيروسي لاستكشاف استراتيجيات علاجية للأمراض والخلايا المستهدفة ذات الصلة التي لم تقدم فيها أنواع AAV التقليدية نتائج مرضية، مثل عدوى HIV والخلايا T، بالإضافة إلى استكشاف نقل الجينات القائم على الناقلات إلى الخلايا الجذعية البشرية وغيرها من الخلايا التي يصعب إصابتها في المزارع الخلوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية هندسة وتطوير مكتبات متنوعة للغاية من ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدة الاصطناعية (adeno associated viral vectors) باستخدام مزيج من تكسير الجينات وإعادة تجميعها، بالإضافة إلى كيفية اختيار هذه المكتبات بشكل أساسي في الخلايا المستزرعة أو في الحيوانات من أجل إثراء القفيصات (capsids) الفردية بخصائص محددة مرغوبة لاستخدامها كناقلات لنقل الجينات. لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات الغدانية (adenovirus) يمكن أن يكون خطيراً، ويجب اتخاذ العديد من الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.