فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت

يوضح هذا الفيديو إجراءً لفصل التجمعات الفيروسية المختلطة بناءً على تكوين حمضها النووي. وهذا يتيح دراسة التنوع التصنيفي والقدرات الوظيفية للتجمعات الفيروسية المعقدة. وفي هذه العملية، يُستخدم الهيدروكسي أباتيت، وهو شكل بلوري من فوسفات الكالسيوم، في فصل الأحماض النووية.

أولاً، يتم تعبئة وعمود من الهيدروكسي أباتيت (Hydroxyapatite) وموازنته، ثم تُطبق الأحماض النووية الفيروسية المنقاة على العمود؛ حيث يؤدي التفاعل الشحني بين أيونات الكالسيوم الموجبة الشحنة في الهيدروكسي أباتيت والعمود الفقري للفوسفات سالب الشحنة في الأنواع الفرعية للأحماض النووية إلى ربط الأحماض النووية بالعمود. بعد ذلك، يتم شطف DNA أحادي السلسلة وRNA وDNA مزدوج السلسلة بالتتابع باستخدام تركيزات مختلفة من محلول الفوسفات المنظم. ثم يتم إزالة الأملاح من الأحماض النووية الناتجة وتركيزها تمهيداً للتصوير والتقدير الكمي والتعريف عن طريق تسلسل DNA. ويؤكد الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز (agarose gel electrophoresis) إمكانية فصل أنواع الأحماض النووية بنسبة انتقال أقل من 9%.

وبذلك، تتيح هذه الطريقة تقييم التنوع والقدرة الوظيفية للمجتمعات الفيروسية. مرحباً، اسمي دوغ فرو، وأنا باحث مساعد في مختبر الدكتورة شانون ويليامسون في معهد ج. كريغ فينتشر. سأعرض لكم اليوم إجراءً لفصل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين أحادي السلسلة، والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين مزدوج السلسلة، والحمض النووي الريبوزي من تجمع فيروسي بيئي.

تتميز هذه الطريقة عن الطرق الحالية، مثل المعالجة بالنواة التي تستهدف إما الحمض النووي DNA أو الحمض النووي الريبوزي RNA. حيث تملك كروماتوغرافيا الهيدروكسي أباتيت القدرة على التقاط المجتمع الفيروسي بأكمله. وتتيح لنا هذه الطريقة الإجابة على عدة تساؤلات في مجال الإيكولوجيا الفيروسية.

على سبيل المثال، ما هو المجموع الجيني الكامل أو تنوع المجتمع الفيروسي؟ لقد فكرنا في هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا دراسة تجمعات العوالق في خليج تشيسابيك بالكامل دون التضحية بجزء من البصمة الوراثية. يجب تحضير المحاليل اللازمة لهذه التجربة مسبقاً وفقاً للإرشادات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق، وتشمل محلولاً منظماً من الفوسفات بتركيز 0.12 molar، ومحلولاً منظماً من الفوسفات بتركيز 0.20 molar، ومحلولاً منظماً من الفوسفات بتركيز 0.40 molar، ومحلول فوسفات بتركيز one molar.

عند درجة pH 6.8 وباستخدام الهيدروكسيباتيت المميأ في يوم التجربة، قم بموازنة جميع محاليل الفوسفات المنظمة والهيدروكسيباتيت المميأ عن طريق وضعها في حمام مائي عند درجة حرارة 60 درجة Celsius. ابدأ هذا الإجراء بتجهيز عمود econo الذي سيُستخدم لفصل الأحماض النووية الفيروسية. قم بتثبيت صنبور إيقاف عند نهاية عمود econo وتأكد من أنه مغلق.

باستخدام الماصة، أضف الماء منزوع الأيونات إلى العمود، ثم ضع الغطاء على الجزء العلوي من العمود واقلب العمود بشكل متكرر لشطفه. صُب الماء وكرر عملية الغسل هذه عدة مرات. بعد ذلك، قم بإزالة صمام الإيقاف من عمود econ وعقمه باستخدام autoclave لتعقيمه.

لا يتم تعقيم صمام الإغلاق بالـ autoclave لأنه سينصهر. اشطف صمام الإغلاق بالماء المؤين، ثم مرة أخرى بـ 70%ethanol واتركه ليجف في الهواء بعد عملية التعقيم. أعد تركيب صمام الإغلاق ثم أغلقه.

بعد ذلك، وأثناء العمل داخل خزانة سحب الأبخرة، أضف 1 mL من sigma coat إلى العمود، ثم قم بطلاء الزجاج الداخلي للعمود عن طريق قلبه بحركة تدويرية كما هو موضح هنا. إن الطلاء باستخدام sigma coat سيقلل من التصاق الأحماض النووية بسطح الزجاج. وأثناء عملية الفصل، تكون أسطح الزجاج المملحة قد طُليت.

افتح صنبور التوقف وأفرغ المحتوى في أنبوب مخروطي. بعد ذلك، ولتوصيل العمود بحمام مائي دوراني، استخدم مشبكين لتثبيت العمود على حامل حلقي. قم بتوصيل أنابيب السيليكون من الحمام المائي الدوراني، بحيث يكون تدفق المياه من الحمام المائي من الأسفل إلى الأعلى.

اضبط درجة الحرارة على 60 °C وابدأ عملية التدوير. من الناحية العملية، يتم لف العمود والأنابيب بمادة عازلة، مثل رقائق الألومنيوم أو عزل الأنابيب الرغوي. لتقليل فقد الحرارة، لم يتم عرض هذه الخطوة هنا.

من أجل تصور الإجراء بشكل أفضل، أغلق صنبور الإيقاف. باستخدام الماصة، أضف 10 milliliters من الماء المعقم الخالي من RNAs. افتح صنبور الإيقاف واسمح للماء بالتصريف.

بعد ذلك، يتم الغسل مجددًا باتباع خطوات الغسلة الثانية. يُشطف العمود مرتين باستخدام 10 milliliters من محلول دريئة الفوسفات بتركيز 0.12 molar المعقم والخالي من الـ RNA، مع سكب المحلول بعد كل عملية غسل. أصبح العمود الآن جاهزًا لكروماتوغرافيا الهيدروكسي أباتيت.

تأكد من إغلاق صمام إيقاف العمود الاقتصادي. ثم باستخدام ماصة سيرولوجية معقمة سعة 2 mL، أضف ببطء 2 mL من هيدروكسي أباتيت المعاد تعليقه والمُعاد ترطيبه والمُحضّر مسبقاً إلى قاع العمود. أعد وضع غطاء العمود.

اترك الهيدروكسي أباتيت يستقر تحت تأثير قوة الجاذبية لمدة 30 دقيقة. تتطلب هذه الطريقة دقة في التفاصيل. تتم معالجة عمود الهيدروكسي أباتيت بمعدل يتراوح بين 0.25 إلى 0.5 mils في الدقيقة.

لذا، من المهم جداً مراقبة العمود بدقة لضمان عدم جفافه. بعد مرور 30 دقيقة، افتح الصنبور لتصريف المحلول المنظم في حاوية النفايات. أغلق الصنبور وتخلص من السائل المار.

امزج الأحماض النووية مع منظم الفوسفات بتركيز 0.12 مولار في حجم نهائي قدره 500 microliters ثم حضن المزيج عند درجة حرارة 60 degrees Celsius لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى موازنة درجة حرارة الأحماض النووية مع درجة حرارة العمود، مما يعزز فصل أنواع الأحماض النووية المختلفة عن طريق إزالة أي بنيات ثانوية قد تكون موجودة. وباستخدام ماصة سيرولوجية سعة two milliliter، قم بإضافة محلول الحمض النووي بسرعة إلى الـ hydroxy appetite، مع الحرص على عدم تحريك العمود.

بمجرد تدفق الـ 500 µL كاملة على العمود، يمكن إضافة كمية صغيرة من منظم الفوسفات بتركيز 0.12 molar إلى أعلى العمود لمنعه من الجفاف. اترك الأحماض النووية لترتبط بالـ hydroxy appetite لمدة 30 دقيقة. بعد فترة حضانة الربط، ضع أنبوباً مخروطياً سعة 15 mL أسفل العمود.

افتح بعد ذلك صنبور الإيقاف واجمع عينة أولية بحجم 500 µL، والتي تحتوي على DNA أحادي الخيط. وبمجرد جمع 500 µL، أغلق صنبور الإيقاف. بعد ذلك، أضف ستة ملليلترات من محلول منظم الفوسفات بتركيز 0.12 M إلى الهيدروكسي أباتيت، مع الحرص على عدم تحريك العمود.

بعد ذلك، افتح صنبور الإيقاف وواصل جمع السائل المتدفق الذي يحتوي على DNA أحادي الخيط في نفس أنبوب الـ 15 milliliter المستخدم في الخطوة السابقة. بعد جمع حوالي ستة milliliters، أغلق صنبور الإيقاف. أضف حجماً واحداً من محلول الفينول والكلوروفورم وكحول الإيزوأميل إلى الأنبوب واخلطه بقوة باستخدام جهاز الـ vortex، ثم قم بالطرد المركزي عند 3,500 ×g لمدة 15 دقيقة.

بعد عملية الطرد المركزي، سيحتوي الأنبوب على طبقتين. انقل الطبقة المائية العليا، التي تحتوي على شريط DNA مفرد، إلى أنبوب جديد سعة 15 milliliter، واحفظ العينة في درجة حرارة الغرفة. لاستخلاص وتنقية RNA من العمود، أضف ستة milliliters من phosphate buffer بتركيز 0.20 molar واجمع السوائل المارة قبل استخدام أنبوب جديد سعة 15 milliliter. ثم قم بإجراء استخلاص باستخدام الفينول والكلوروفورم.

أما بالنسبة لعينة DNA أحادي الخيط، فكرر هذه العملية باستخدام 6 mL من منظم الفوسفات بتركيز 0.40 M لاستخلاص وتنقية DNA ثنائي الخيط من العمود. وأخيراً، لإزالة أي DNA ثنائي الخيط متبقٍ من العمود، كرر هذه العملية مرة واحدة أخرى.

استخدم هذه المرة 6 mL من محلول الفوسفات المنظم بتركيز 1.00 M لإزالة الأملاح من عينات الحمض النووي. انقل من 4 إلى 5 mL من كل عينة إلى جهاز ترشيح طرد مركزي Ultra-4 مجهز بغشاء خلية فائقة بحد قطع للوزن الجزيئي قدره 30,000 Da، وقم بتركيز العينة إلى أقل من 500 µL عن طريق الدوران بسرعة 6,000 ×g عند درجة حرارة 30 °C لمدة خمس دقائق تقريبًا في دوار ثابت الزاوية. بعد التخلص من السائل المُرشح، أضف المتبقي من العينات إلى المرشح.

ارفع الحجم إلى 4 إلى 5 milliliters باستخدام RNAse-free 1X TE buffer. بعد ذلك، قم بالتدوير المركزي مرة أخرى حتى يتم الحصول على حجم مركز. وبعد حوالي خمس دقائق من التدوير المركزي، أضف 4 إلى 5 milliliters من RNAse-free 1X TE buffer إلى المرشح والمركز.

كرر عملية الغسيل هذه خمس مرات إضافية لإزالة الأملاح تماماً من عينات الحمض النووي. وبمجرد تركيز عينات الحمض النووي وإزالة الأملاح منها بالكامل، انقل العينات المتبقية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.7 milliliter. قم بترسيب الأحماض النووية بإضافة خُمس حجم العينة من خلات الصوديوم، وحجمين من 100%ethanol، وميكرولتر واحد من glyco blue، مع المزج جيداً باستخدام جهاز دوامة الطرد المركزي (vortexing centrifuge).

طرد مركزي بسرعة 28,000 GS عند درجة حرارة 4 °C لمدة 60 دقيقة. مع التأكد من عدم تعريض الراسب للاضطراب.

أضف 300 µL من الإيثانول بتركيز 70% ثم قم بالتدوير بسرعة 28,000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ثم جفف العينة وأعد تعليق كل جزء في حجم مناسب من منظم TE buffer الخاص بـ RNAs. تم دمج تركيزات متساوية من الأحماض النووية الفيروسية M 13 MP 18 (DNA أحادي السلسلة)، وMS two (RNA أحادي السلسلة)، وFI six (RNA مزدوج السلسلة)، وlambda (DNA مزدوج السلسلة)، ثم فُصلت باستخدام كروماتوغرافيا الهيدروكسيباتيت كما هو موضح في هذا الفيديو. تم دمج تركيزات متساوية من M 13 MP 18 (DNA أحادي السلسلة)، وMS two (RNA أحادي السلسلة)، وfive six (RNA مزدوج السلسلة)، وLambda (DNA مزدوج السلسلة) كما هو موضح في المسار 6، ثم وُضعت على عمود هيدروكسيباتيت كما يظهر هنا.

تم استخلاص DNA-RNA أحادي السلسلة وDNA مزدوج السلسلة بشكل مستقل من عمود الهيدروكسيباتيت باستخدام منظم الفوسفات بتركيزات 0.12 مولار و0.18 مولار و0.40 مولار و1.00 مولار. واستخدم سُلّم 1 KB لتأكيد أحجام الجينوم. وتشير هذه النتائج إلى أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لفصل DNA أحادي السلسلة وDNA مزدوج السلسلة وRNA بنجاح، مع انتقال أقل من 9% من جزء إلى الجزء الذي يليه.

تم استخدام هذه الطريقة أيضًا لفصل الأحماض النووية المعزولة من مجتمع فيروسي داخل خليج تشيسابيك، كما هو موضح هنا. تم استخلاص DNA وRNA أحادي الخيط وDNA مزدوج الخيط بشكل مستقل باستخدام تركيزات من منظم الفوسفات تبلغ 0.12 molar و 0.20 molar و 0.40 molar، أو 1.00 molar على التوالي. استُخدم سلم DNA عالي الكتلة في المسار الأول وسلم 1 KB في المسار الثاني للتأكيد بصرياً على الوزن الجزيئي والكتلة التقريبية للأحماض النووية كما يظهر هنا؛ وكان DNA مزدوج الخيط هو النوع السائد من الأحماض النووية المستخلصة من العوالق الفيروسية في خليج تشيسابيك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل الأحماض النووية من مجموعة فيروسية مختلطة باستخدام كروماتوغرافيا الهيدروكسيباتيت.

يتضمن ذلك تحضير عمود الهيدروكسيباتيت والأحماض النووية، وفصل واستخلاص الأحماض النووية باستخدام تركيزات مختلفة من منظم الفوسفات وإزالة الأملاح، وتركيز الأحماض النووية بعد الفصل.