المحلية والعالمية طرق تقييم Nociception الحرارية في

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار استقبال الألم الحراري في يرقات ذبابة الفاكهة (drosophila). ويتحقق ذلك من خلال جمع يرقات drosophila لتعريضها لاحقًا لمحفزات حرارية مؤلمة، وفي خطوة ثانية اختيارية، يمكن تعريض اليرقات للإشعاع فوق البنفسجي (UV)، مما يسبب تلفًا في الأنسجة وزيادة الحساسية لاستقبال الألم الحراري. بعد ذلك، يمكن فحص اليرقة موضعيًا باستخدام مسبار حراري أو بشكل عام باستخدام لوح تسخين من أجل تحفيز استجابات استقبال الألم التي يمكن قياسها كميًا.

يُظهر مسبار الحرارة أن اليرقات لديها سقف للاستجابة لاستقبال الألم الحراري، وعلاقة مفاجئة بين درجة حرارة المدخلات وسعة الاستجابة المستحثة. كما يُظهر اختبار الصفيحة الحرارية أن اليرقات تظهر تسلسلاً نمطياً من سلوكيات استقبال الألم التي تعتمد على درجة حرارة الماء المحيط ونشاط العصبونات الحسية المسؤولة عن استقبال الألم. ويمكن للطرق الموصوفة هنا أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال استقبال الألم الحراري، مثل ما إذا كانت الحيوانات تستجيب بشكل مختلف للمنبهات الحرارية الضارة التي يتم تقديمها سواء بشكل موضعي أو شامل.

بشكل عام، يواجه الأشخاص الجدد في اختبار مسبار الحرارة (heat probe assay) بعض الصعوبات لأن إتقان هذا الاختبار يتطلب ممارسة لتقليل التباين في الضغط، والموقع، وزاوية توجيه المسبار المستخدم، لذا فإن العرض المرئي لاختبار صفيحة الحرارة يُعد أمراً بالغ الأهمية، حيث يجب رؤية السلوكيات الناتجة عن ارتفاع درجة الحرارة لتقديرها بشكل أفضل. وللحصول على عدد كافٍ من اليرقات الناتجة ذات النمط الجيني المحدد المطلوب، يتم تربية السلالة المطلوبة مباشرة أو إجراء عمليات تزاوج في زجاجات تحتوي على غذاء الذباب باستخدام 20 إلى 30 أنثى عذراء و15 إلى 20 ذكراً؛ وبعد خمسة أيام من وضع البيض، يتم جمع وتنظيف يرقات المرحلة الثالثة المبكرة عن طريق إزالة غذاء الذباب اللين وتصفيتها بماء جارٍ بلطف عبر شبكة ذات حجم مسام 630 micron، ثم تُنقل يرقات المرحلة الثالثة المبكرة إلى قطعة صغيرة ورطبة من الغذاء لمنع المجاعة والجفاف.

بعد تجهيز غرفة التخدير، استخدم الملقط أو فرشاة رسم لوضع 10 يرقات في بداية الطور الثالث برفق على طول الجانب الداخلي للغطاء ثم أغلقه. وأثناء العمل داخل خزانة استخراج الأدخنة، ضع غرفة التخدير داخل جرة ربط تحتوي على كأس سعة 10 milliliter وبداخله كرة قطنية مشبعة بـ 1.5 milliliters من dathyl ether. أحكم ربط غطاء جرة الربط لتعريض اليرقات لأبخرة الإيثر لمدة تتراوح من دقيقتين إلى 2.5 دقيقة.

بعد عملية التخدير، أخرج غرفة التخدير من وعاء Coplan واتركها لبضع ثوانٍ داخل خزانة سحب الغازات لتتلاشى أي أبخرة إيثر متبقية. استخدم زجاجة رش المياه لشطف اليرقات برفق من غرفة التخدير ونقلها إلى طبق بتري صغير. جفف اليرقات المخدرة عن طريق التربيت عليها، ثم ثبتها برفق بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى على شريط من شريط لاصق مزدوج الوجه مثبت على شريحة مجهرية زجاجية مقاس 3 بوصات في بوصة واحدة.

ضع الشريحة على السطح السفلي لغرفة التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (UV)، وعرّض اليرقات لضوء UV لمدة ست ثوانٍ بكثافة 20 millijoules per centimeter squared. بعد التشعيع، اغمر الشريحة في الماء لجعل اليرقات تطفو برفق بعيداً عن الشريط اللاصق ذي الوجهين. استخدم ملقطاً أو فرشاة رسم لنقل اليرقات المشععة برفق إلى وعاء بمقاس 15 by 45 millimeter.

قارورة زراعة زجاجية سعة درام واحد تحتوي على 1 mL من غذاء الذباب للاستعادة لمدة تتراوح من 8 إلى 24 ساعة عند 25 °C أو درجة حرارة الزراعة المطلوبة قبل إعادة استضافتها. بالنسبة لاختبارات استقبال الألم الحراري، قم أولاً بضبط درجة حرارة المسبار الحراري على نقطة الضبط المطلوبة. استخدم فرشاة رسم أو ملقطاً لنقل يرقة واحدة برفق إلى منصة مسطحة، مع التأكد من أن اليرقة مغطاة بطبقة رقيقة من الماء.

من أجل تقليل التباين في الضغط وكذلك لضمان الموقع والزاوية الصحيحين لمسبار الحرارة، فإن التدريب هو سبيل الإتقان. اضغط بلطف بطرف المسبار على اليرقات عند القطعة A four، مع تطبيق ضغط خفيف بحيث تكون الزاوية بين المسبار وسطح اليرقة حوالي 45 درجة. يجب أن يتسبب هذا الضغط في إحداث انبعاج طفيف على سطح اليرقة، وعادة ما يكون ذلك كافياً لمنع الحركة.

استمر في تحفيز اليرقات حتى يظهر استجابة انسحاب أو حتى الوصول إلى الحد الزمني النهائي الثاني والعشرين. تظهر اليرقات المستجيبة عادةً سلوكاً أولياً يتمثل في رفع الرأس والذيل، يليه سلوك الانسحاب المتمثل في الدوران بزاوية 360 درجة على الأقل. وبمجرد بدء سلوك الانسحاب، ارفع المسبار عن اليرقة وسجل فترة الكمون أو الوقت المستغرق للانسحاب.

إذا لم يتم ملاحظة سلوك انسحاب خلال 20 ثانية، فإن اليرقة تُعتبر غير مستجيبة. قم بتوجيه أدلة الضوء من الألياف البصرية لضمان وجود إضاءة كافية وعالية التباين. لعرض اليرقات، ضع كتلة التسخين في لوحة التسخين بحيث يكون السطح المستوي للأعلى، ثم ضع لوحة التسخين على قاعدة المجهر.

قم بتشغيل لوح التسخين على الإعداد العالي واتركه لمدة 15 دقيقة تقريبًا حتى تستقر درجة الحرارة عند 95 درجة Celsius. قم بقياس 80 µL من الماء المقطر وضع قطرة الماء في منتصف طبق بتري من البوليسترين بمقاس 60 في 15 mm باستخدام ماصة دقيقة. استخدم الملقط لوضع يرقة نظيفة في طور العمر اليرقي الثالث الأوسط برفق في منتصف قطرة الماء، مع الحرص على إضافة أقل قدر ممكن من الماء الإضافي.

ضع طبق بتري برفق فوق كتلة التسخين الصلبة الموجودة على لوحة التسخين. اضبط موقع الطبق بسرعة بحيث تكون اليرقة بالكامل وقطرة الماء في مجال الرؤية. ابدأ تشغيل المؤقت.

في هذه اللحظة، يتم وضع طبق بتري على الكتلة التسخينية الصلبة للصفيحة الساخنة ويتم تسجيل وقت بدء كل سلوك. خامساً. تُلاحظ سلوكيات حركية نمطية عند نقل اليرقة المغمورة في الماء إلى الصفيحة الساخنة. يتضمن السلوك الطبيعي في غياب الحرارة الحركة المظلية، المصحوبة بحركات بحثية للرأس.

يمكن أن يظهر سلوك اهتزاز الرأس لاحقاً، حيث تحرك اليرقة رأسها بسرعة في حركة أمامية أو جانبية. تشبه هذه الحركة حركتها الطبيعية في الماء، ولكنها تحدث بشكل أكثر تشنجاً وتدحرجاً مستمراً. ويحدث هذا السلوك عندما تتدحرج اليرقة جانبياً بزاوية 360 درجة كاملة على الأقل.

يمكن أن يحدث هذا لعدد متغير من المرات، ويتضمن أحيانًا دورانات غير مكتملة. ولغرض تسجيل السلوك، يتم حساب الدورانات الكاملة بمقدار 360 درجة فقط. هذا السلوك هو الأكثر تشابهًا مع المشهد الذي يتضمن التطبيق الموضعي لمسبار الحرارة أثناء سلوك السوط.

تظهر اليرقة حركات انقباض وانبساط سريعة على طول المحور الأمامي الخلفي، مما يجعل الرأس يقترب لفترة وجيزة جداً من الذيل. وغالباً ما يُلاحظ حدوث السوط (Whipping) في تتابع سريع، أو في وقت واحد مع التدحرج (rolling). وأخيراً، تظهر اليرقة سلوك التشنج الذي يتبعه غالباً الشلل. وخلال سلوك التشنج، تتمدد اليرقة على طول المحور الأمامي الخلفي وتظهر اهتزازات عالية التردد في كامل الجسم.

يحدث سلوك الارتجاف دون شلل الانحناء عندما تتوقف اليرقات عن الحركة. يكون هذا الأمر دائماً في بعض اليرقات، بينما تظهر يرقات أخرى حركة نبضية منخفضة التردد. في هذا المخطط لنسبة المستجيبين المنتمين إلى كل فئة، يوجد سقف لاستجابة اليرقات للإحساس الحراري بالألم. في مقايسة مسبار الحرارة، تكون 100% من اليرقات مستجيبة سريعة حتى تصل درجة حرارة المسبار إلى 52 degrees Celsius.

ومع ذلك، عند درجة حرارة 54 °C أو أعلى، تفشل 90% أو أكثر من اليرقات في الاستجابة حتى بعد 20 ثانية من التلامس. وعلى الرغم من أن هذه اليرقات تستمر في الحركة بعد نقطة القطع الثانية والعشرين، إلا أنه يمكن قياس ورسم عدد الدورات أو الوقت المستغرق في سلوك الانسحاب النفوري. ومن المثير للدهشة، يبدو أن هناك علاقة عكسية بين درجة حرارة المسبار وقوة الاستجابة، حيث يبدو أن درجات الحرارة المنخفضة تحفز عدداً أكبر من الدورات.

تُلاحظ خمسة سلوكيات حركية نمطية عند نقل اليرقة المغمورة في الماء إلى الصفيحة الساخنة. وتظهر هنا متوسطات فترات الكمون التي لوحظت عندها هذه السلوكيات، بالإضافة إلى متوسط درجات حرارة قطرة الماء المقاسة لكل فترة كمون في ظل ظروف المقايسة المثالية المعروضة هنا؛ حيث تراوحت نسبة اليرقات التي أظهرت كل سلوك مميز من 77 إلى 100%، على الرغم من أن سلوكي التدحرج والضرب قد يتم تخطيهما أحياناً، أو يتداخلان، أو يحدثان بترتيب عكسي. كما تظهر هنا نسبة اليرقات التي نجت بعد بدء سلوك الشلل في مقايسة الصفيحة الساخنة. وقد تم تسخين اليرقات حتى حدوث الشلل، ثم نُقلت بعد ذلك إلى ظروف استزراع قياسية للتعافي.

تلقّت اليرقات التي خضعت للمعاملة الصورية معاملة مكافئة باستثناء التعرض للحرارة، وكان تكوين PPE في البالغين القابلين للحياة كميّاً من اليوم السابع إلى اليوم 13. هنا، يحفز MD G four تعبير الجينات المنقولة المنظمة بواسطة UAS في جميع الفئات الأربع من العصبونات الحسية الطرفية متعددة التغصنات. يعبر UAS or one delta C عن نسخة معدلة من قناة البوتاسيوم المفتوحة المصلحة في ذبابة الدروزوفيلا والضرورية للنقل المشبكي، بينما يعبر UAS orrc one delta NC عن نسخة معدلة بشكل إضافي من القناة نفسها بحيث لا تتداخل مع النقل المشبكي.

لاحظ أن اليرقات التي تحمل كلًا من محرك MD GALF four والجين المنقول UAS ORC one delta C فقط هي التي تظهر زيادة في فترات الكمون لأربعة من السلوكيات الخمسة الملحوظة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الاستجابات المحلية والعامة ليرقات GEs offal تجاه المثيرات الحرارية الضارة. يمكن دمج هذه الإجراءات مع طرق أخرى مثل التحليل الجيني لتحديد الجينات المطلوبة لاستقبال الألم الحراري. عند محاولة إجراء اختبار المسبار الحراري، من المهم تذكر تقليل التباين في الضغط، والموقع، وزاوية تلامس المسبار.