تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

لتحليل الآليات الخلوية لاستيعاب الجسيمات النانوية والبكتيريا عن طريق قياس التدفق التصويري متعدد الأطياف. يتم أولاً معالجة الخلايا البلعمية مسبقاً بـ cyto klain D لتثبيط بلمرة الأكتين. ثم تُضاف الجسيمات النانوية أو salmonella إلى الطبقة الأحادية من الخلايا البلعمية وتُحضن.

بعد ذلك، يتم حصاد الخلايا البلعمية وتثبيتها ووسمها لتحليلها باستخدام تدفق الصور. ومن خلال مقياس تدفق الخلايا التصويري متعدد الأطياف، يتم التمييز بين الخلايا التي استوعبت الجسيمات النانوية و/أو السالمونيلا، وتلك التي ارتبطت الجسيمات النانوية و/أو السالمونيلا بسطحها فقط. وتشير البيانات الناتجة إلى أن السالمونيلا والجسيمات النانوية يتم استيعابهما فقط من قبل الخلايا التي لم تُعالج بـ cyto klain.

مما يشير إلى أن عملية الإدخال الخلوي تعتمد على الأكتين. وتتميز هذه التقنية بعدة مزايا مقارنة بالطرق الحالية مثل قياس التدفق الخلوي والمجهر البؤري، حيث توفر بشكل أساسي قياساً دقيقاً لشدة الإشارات الفلورية والتحليل المكاني بين السمات الخلوية المختلفة بسرعة عالية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في أبحاث لقاحات المواد الحيوية وأنظمة توصيل الأدوية، بالإضافة إلى دراسات التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض. ويشمل ذلك تحديد مسارات الاستيعاب الخلوي التي تستخدمها الجسيمات النانوية من البولي أنهيدريد والبكتيريا. وبشكل عام، غالبًا ما يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات.

من المهم تخصيص وقت لمعايرة الأصباغ من أجل الحصول على إشارات فلورية مثالية. كما أن التعرف على البرنامج وإنشاء نماذج التحليل يستغرق وقتاً. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا أن الجسيمات النانوية المائية المتعددة تظهر خصائص تحاكي الممرضات أثناء استخدام المجهر وتقنيات أخرى.

أردنا بعد ذلك الحصول على نظام عالي الإنتاجية لمقارنة عمليات الاندماج الخلوي التي تستخدمها السالمونيلا وجسيمات pollen hydride النانوية قبل إجراء المقايسة. يجب حصاد جميع المزارع الخلوية الثديية والبكتيرية وتحضير معلقات الجسيمات النانوية. ابدأ بحصاد خلايا RAW 264.7 الملتئمة باستخدام كاشطة الخلايا.

قم بتحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس دم (hemo cytometer). بعد ذلك، قم بتوزيع الخلايا في طبق زراعة مكون من 24 بئرًا بكثافة 5 × 10⁵ خلية لكل بئر في 0.5 milliliters من وسط DMEM كامل، ثم حضنها طوال الليل عند 37 °C في حضانة تحتوي على 5%CO2.

لتحضير مستنبت السلمونيلا (salmonella tarica)، يتم تخفيف السلمونيلا في وسط C-D-M-E-M للحصول على تعدد عدوى قدره 100 لكل خلية من خلايا RA W2 64.7 في أنبوب زراعة زجاجي ذو غطاء لولبي قابل للتعقيم بالتمرير الحراري بحجم 16 × 125 مم. بعد ذلك، وباستخدام ورق وزن معقم، يتم وزن 5 mg من جسيمات بولي أنهيدريد النانوية المحملة بـ 1% FITC، والمحضرة وفقاً لما وصفه زملاء ريان في منشورهم لعام 2009 في مجلة Pharmaceutical Research، وذلك في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 mL. تُضاف الجسيمات النانوية إلى 0.5 mL من محلول ملحي منظم بالفوسفات البارد، ثم يوضع المزيج على الثلج.

مع الحفاظ على الأنبوب في الثلج، استخدم معالجاً للسوائل بالموجات فوق الصوتية مع رأس دقيق لإجراء عملية السونيكة للمعلق لمدة 25 ثانية تقريباً وبطاقة تتراوح بين أربعة إلى ستة جول. الآن وبعد أن أصبحت جميع الخلايا والكواشف المطلوبة جاهزة، يمكن إجراء مقايسة البلعمة.

قم بوضع ملصقات على 24 طبق زراعة أنسجة بآبار تحتوي على خلايا RA W2 64.7 مستنبتة تحضيراً للمقايسة في الطبق الأول. سيتم فحص كل عينة من العينات التالية في ثلاث مكررات: cyto and D مع الجسيمات النانوية، cyto and D مع salmonella، الوسط مع الجسيمات النانوية، الوسط مع salmonella، الجسيمات النانوية فقط، salmonella فقط، وخلايا ملوّنة بـ AF six 60 فقط. سيتم فحص ضوابط درجة حرارة 4 °C في الطبق الثاني وستشمل الوسط زائد الجسيمات النانوية والوسط زائد salmonella. إن الحضن في هذه الدرجة المنخفضة يؤدي إلى إبطاء العمليات الخلوية مثل البلعمة. قبل ساعة واحدة من الاستحثاث، أضف 5 µg/mL من cyto and D و C-D-M-E-M إلى الآبار المناسبة واحضن الخلايا عند 37 °C.

بعد فترة التحضين، قم برج معلق الجسيمات النانوية باستخدام جهاز الـ vortex، وأضف 10 µL إلى الآبار المناسبة. بعد ذلك، قم برج السالمونيلا (salmonella) باستخدام جهاز الـ vortex وأضفها إلى الآبار المناسبة بـ MOI قدره 100. انقر على الطبق بضع مرات للمزج.

ثم يتم وضع أطباق العينات عند 37 درجة مئوية وأطباق الضابط السلبي عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضن، توضع الأطباق على الثلج، وتغسل الخلايا مرتين بمحلول PBS مبرد بالثلج وخالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم عن طريق سحب والتخلص من الوسط القديم لإزالة الجسيمات غير المرتبطة، والسالمونيلا، والخلايا الميتة أو المنفصلة. استخدام بتال المغنيسيوم.

يُعد استخدام PBS مسبقاً في هذه المرحلة أمراً ضرورياً لأنه يسهل انفصال الخلايا عن الركيزة. ولجمع الخلايا، أضف 250 µL من PBS المبرد بالثلج واكشط الآبار برفق، ثم انقل الخلايا المجمعة باستخدام الماصة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات أغطية محكمة وسيليكونية، واحفظها على الثلج. اغسل الخلايا بإضافة 1 mL من محلول الغسيل المبرد، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 250 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد التخلص من السائل الطافي، تخلص من المحلول المتبقي عن طريق النقر على أنبوب الطرد المركزي الدقيق المقلوب فوق ورقة امتصاص.

أعد تعليق كتلة الخلايا عن طريق تحريك أنبوب الطرد المركزي الدقيق برفق فوق حامل أنابيب الاختبار. ولتثبيت الخلايا، أضف 100 µL من البارافورمالدهيد بتركيز 4% في PBS واترك الخلايا لمدة 15 دقيقة. وفي درجة حرارة الغرفة، اغسل الخلايا بإضافة 1 mL من محلول غسيل perm، ثم قم بالطرد المركزي عند 250 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

بعد التخلص من السائل الطافي، قم بإزالة المحلول المنظم المتبقي كما سبق. ثم ابدأ بصبغ خلايا RA W2 64.7. بالنسبة للأكتين، أضف 100 µL من محلول غسيل النفاذية الذي يحتوي على Alexa Fluora foid in six 60 لمدة 15 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة، يجب تحضين العينات غير المصبوغة مع perm وwash buffer بدون phin. بعد الصبغ، يتم غسل الخلايا وطردها مركزياً مرة أخرى، ثم إعادة تعليقها في 50 µL من PBS يحتوي على 1% PFA وتخزينها في الظلام عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت الحصول على الصور. قم بتشغيل الجهاز، وبدء تدفق الصور، والإطلاق.

قم بإجراء عملية السحب والبدء (Inspire and initialize) لنظام السوائل من قائمة الملفات. اختر تحميل القالب الافتراضي. في معرض الصور، ومن قائمة العرض، حدد الكل ثم اضغط على تشغيل الإعداد (run setup) لبدء تصوير الخرزات إذا لزم الأمر، وقم بضبط تتبع النواة لتوسيط الصور جانبيًا.

حدد قناة المجال المضيء (brightfield) وانقر على تعيين الشدة (set intensity). انتظر حتى يصبح معامل الاختلاف لسرعة التدفق أقل من 0.2% بشكل مستمر. في علامة تبويب المساعدة (assist)، انقر على بدء الكل (start all) لتشغيل المعايرات والاختبارات، وتحقق من اجتياز الجميع في البرنامج. انقر على تحميل العينة (load sample).

بعد ذلك، وعندما يُطلب منك ذلك، ضع الأنبوب الذي يحتوي على العينة الأكثر سطوعاً. ومع وجود جميع الفلوروكرومات في محمل العينات، اختر تكبيراً بمقدار 40x. وبمجرد تحديد إعدادات الجهاز، لا تقم بتغييرها طوال التجربة.

قم بتشغيل كل ليزر في التجربة من خلال النقر على أيقونات الليزر في البرنامج، واضبط قدرة الليزر بحيث يكون لكل فلوروكوم (fluorochrome) أقصى قيم بكسل بين 104, 000 عدّة كما يتم قياسها في مخططات التشتت. ولتجنيد تجميع الأجسام غير المرغوب فيها، انقر على نافذة مصنف الخلايا في البرنامج. بعد ذلك، ولجمع بيانات الخلايا فقط، حدد الحد الأدنى للمساحة للقناة الأولى للمجال المضيء (brightfield)، واضبط القيمة على 50 ميكرومتر؛ حيث ستعتبر الأجسام التي تقل مساحتها عن 50 ميكرومتر حطاماً ولن يتم الحصول عليها.

حدد القنوات المراد جمع بياناتها بالنقر فوق أيقونات القنوات المناسبة في البرنامج هنا. يتم اختيار القنوات 1 و2 و3 و4 و5 و6 ضمن علامة تبويب الإعداد (setup tab). أدخل رقم الملف ومجلد الوجهة.

اضبط رقم التسلسل على 1 وعدد الأحداث المراد اكتسابها على 5,000. انقر على run، acquire لجمع وحفظ ملف بيانات التجربة الأول. انقر على FLL وقم بتشغيل العينة التجريبية التالية.

كرر العملية حتى يتم جمع كافة العينات التجريبية. بعد ذلك، ولتشغيل الضوابط، انقر فوق إعدادات التعويض (comp settings)؛ سيؤدي ذلك إلى إيقاف تشغيل المجال المضيء وليزر التشتت، وتفعيل جمع كافة قنوات الفلورية تحت علامة تبويب الاستحواذ (acquire).

قم بتغيير قيمة الإدخال إلى 500. بعد ذلك، ضع أنبوبة التحكم وانقر على تشغيل (run). قم بالاكتساب لجمع 500 خلية إيجابية في ضوابط الصبغ الفردية.

كرر هذه الخطوات لكل فلوروكروم في التجربة لإنشاء مصفوفة تعويض. وبمجرد الحصول على جميع صور العينات، قم بتشغيل برنامج تحليل ideas على جهاز كمبيوتر تحليل منفصل عن طريق النقر المزدوج فوق أيقونة ideas على سطح المكتب. ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق معالج الاستيعاب الخلوي (internalization wizard) وقم بتحميل أحد ملفات RIF الخاصة بعينة الاختبار.

ستظهر نافذة منبثقة تقدم تعليمات حول كيفية تحميل ملفات الاختبار. اتبع التعليمات ثم انقر فوق الزر "التالي". بعد ذلك، انقر فوق "مصفوفة جديدة".

سيؤدي هذا إلى تشغيل معالج التعويض. عند ظهور المطالبة، اختر ملفات البيانات الخاصة بضوابط اللون الواحد لإضافتها. انقر على "التالي" عبر المعالج متبعاً الإرشادات حتى يتم حفظ ملف مصفوفة التعويض وتحميله في المربع الموجود في الخطوة الثانية من معالج الاستدخال.

انقر فوق "التالي" واتبع الإرشادات حتى يتم إنشاء ملف DAF. قم بضبط خصائص عرض الصور عن طريق تحديد قنوات الصور المستخدمة أثناء عملية الالتقاط. انقر على القناة الثانية لـ FITC والقناة الخامسة لـ AF six 60.

يتم اختيار الحقل المضيء (Brightfield) والتبعثر الجانبي (side scatter) افتراضيًا. اختر قناة الحقل المضيء O لتحديد حدود الخلية، والقناة O2 التي جُمعت فيها الجسيمات النانوية أو البكتيريا للمسبار الداخلي لتحديد مجتمع الخلية الواحدة، ثم يتم إنشاء مخطط تشتت لمساحة الحقل المضيء مقابل النسبة الباعية للحقل المضيء لجميع الخلايا. يتطلب التحليل عالي الإنتاجية لملفات بيانات متعددة وجود ملف نموذج، لذا من الأهمية بمكان تحديد البوابات (gates) بدقة أثناء إنشاء ملف النموذج.

تمثل كل نقطة القيم الخاصة بصورة خلية فردية. انقر فوق نقطة واحدة في الرسم البياني لاختيار صورة تلك الخلية المحددة في معرض الصور.

بعد ذلك، قم برسم بوابة حول الخلايا التي تتوافق مساحتها ونسبة العرض إلى الارتفاع فيها مع أحداث الخلية الواحدة. تتميز الخلايا المفردة بنسبة عرض إلى ارتفاع تقارب 1، بينما تتميز الخلايا المزدوجة بنسبة عرض إلى ارتفاع تقارب 0.5.

انقر فوق خلايا متعددة للتمييز بين المنطقة التي تحتوي على خلايا مفردة مقابل الخلايا المزدوجة أو الحطام. لإنشاء مخطط تكراري لجذر متوسط مربع تدرج المجال المضيء لصورة المجال المضيء، انقر فوق الزر "التالي".

بعد ذلك، من علامة تبويب التعداد السكاني (population)، اختر خيار السلالات (bin) لعرض السلالة المحددة. انقر فوق السلالات لتحديد مكان وجود الخلايا وأفضل بؤرة تركيز. ابدأ برسم منطقة خطية لعمل بوابية (gate) للخلايا التي تم تركيزها.

كلما كانت قيمة جذر متوسط المربعات (RMS) للتدرج أعلى، كان التركيز أفضل؛ لذا تخطَّ الخطوة التالية ما لم تكن هناك صبغات أخرى يجب تحديد بواباتها. يتم إنشاء مخطط تشتت جديد يوضح شدة القناة الثانية على المحور السيني مقابل أقصى قيمة للبكسل في القناة الثانية على المحور الصادي. انقر فوق النقاط وعاين الصور للمساعدة في تحديد المنطقة التي سيتم رسمها حول الخلايا الإيجابية للجسيمات النانوية أو البكتيريا.

يتم إنشاء مدرج تكراري لسمة الاستدخال (internalization feature) مع تحديد منطقة تبدأ من الصفر، والتي يجب ضبطها من خلال ملاحظة الصور. وتُعد سمة الاستدخال نسبة شدة الإضاءة داخل الخلية إلى شدة الإضاءة للخلية بأكملها. وقد تم ضبط مقياسها بحيث تشير القيمة صفر إلى أن نصف الشدة يقع في الداخل.

قام المعالج بإنشاء منطقة لكل خلية تحدد الجزء الداخلي عن طريق صنع قناع يُستخدم مع صورة الخلية المدخلة للعثور على سطح الخلية، ثم تم تآكل هذا القناع بمقدار أربعة بكسلات. يرجى ملاحظة أنه يمكن تعديل هذا القناع يدويًا لأنواع الخلايا المختلفة عند الضرورة، وذلك عن طريق إنشاء قناع كائن على صورة الحقل المضيء أولاً ثم تآكله بمزيد من البكسلات أو أقل. ويتم حساب ميزة الاستيعاب الداخلي بناءً على قناع الكائن المتآكل هذا باستخدام خوارزمية في البرنامج.

تتيح لنا هذه الميزة التمييز بين الجسيمات والبكتيريا التي تم استيعابها داخلياً، والتي تتركز غالبية إشارتها الفلورية ضمن حدود القناع، وبين الجسيمات والبكتيريا المرتبطة بالسطح، والتي تتركز غالبية إشارتها الفلورية خارج حدود القناع كما هو موضح في هذا المثال؛ قم بإنشاء مدرج تكراري جديد بميزة استيعاب داخلي جديدة بناءً على قناع الكائن المتآكل. ارسم منطقة لتحديد الخلايا المستوعبة داخلياً من خلال عرض الصور في وضع الفئات المختارة. اضبط البوابة عند 0.3 هنا.

تُعتبر الخلايا التي تسجل درجة أقل من 0.3 خلايا موجبة للجسيمات المرتبطة بالسطح. لاستبعاد الخلايا ذات الوسم الخلفي وتحديد الجسيمات النانوية أو البكتيريا الممتصة داخلياً بشكل محدد، اختر الميزات من قائمة التحليل. انقر فوق قائمة التحليل.

ثم انقر على ميزة عد البقع (spot count) لإضافة متوسط عدد البقع إلى تقرير الإحصائيات. في قائمة التقارير، انقر على أيقونة التقارير، ثم حدد تقرير الإحصائيات، ثم أضف الأعمدة، ثم اختر مجموعة الخلايا المناسبة.

انقر فوق موافق. سيقوم معالج الاستيعاب تلقائياً بإضافة الإحصائيات إلى هذا التقرير لحفظ ملف البيانات كملف قالب ليتم استخدامه في التحليل الدفعي لجميع الملفات التجريبية. انقر فوق قائمة الملف واختر حفظ كقالب.

ملفات القوالب. تحمل الامتداد .AST لتحليل ملفات بيانات متعددة في برنامج idea. انقر فوق الأدوات واختر ملفات البيانات المجمعة وقم بإدخال جميع ملفات RIF.

أضف ملف مصفوفة التعويض وملف القالب في الأقسام المقابلة لتقديم الدفعة للمعالجة، ثم انقر على "إرسال" (submit). وبعد خطوة المعالجة، يتم تحليل جميع ملفات RAF وإنشاء ملفات DAF لكل ملف خام من الملفات الفردية. كما يتم إنشاء تقرير نهائي يتضمن إحصائيات لجميع العينات لمقارنة تأثير تثبيط الأكتين ودرجة الحرارة المنخفضة على عملية البلعمة لبكتيريا salmonella والجسيمات النانوية.

تم تحضين خلايا RA W2 64.7 عند 37 درجة مئوية في وسط زراعي، إما بوجود أو بدون cyto klain D، أو تم تحضينها في وسط زراعي عند أربع درجات مئوية. أدى كل من التلاعب في درجة الحرارة والأكتين إلى تقليل استدخال كل من الجسيمات النانوية والسالمونيلا. ومع ذلك، فإن تحضين الخلايا في cyto و D أدى إلى زيادة نسبة الخلايا التي تحتوي على جسيمات نانوية مرتبطة بالسطح، بينما قلل من نسبة الخلايا التي تحتوي على سالمونيلات مرتبطة بالسطح.

تزداد نسبة الخلايا الإيجابية للجسيمات النانوية المرتبطة بالسطح من 8% تقريبًا عند 37 °C إلى أكثر من 35% بعد المعالجة بـ cyto and D أو عند 4 °C. وفي المقابل، انخفضت نسبة الخلايا المرتبطة بسطح السالمونيلا من 35% إلى 15% بعد المعالجة بـ cyto and D. وأدى تحضين خلايا RA W2 64.7 مع السالمونيلا عند 4 °C إلى تقليل عملية الإدخال الخلوي دون زيادة ملحوظة في كمية البكتيريا المرتبطة بالسطح مقارنة بعينة الضابطة عند 37 °C. وتظهر هذه البيانات مجتمعة أن السالمونيلا والجسيمات النانوية يتم إدخالهما خلوياً عبر عملية خلوية مماثلة تتطلب وجود الأكتين وتعتمد على درجة الحرارة.

علاوة على ذلك، تشير البيانات إلى أن الارتباط المستمر لبكتيريا salmonella بالبلعميات يتطلب بلمرة الأكتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية فحص الإدخال الخلوي للجسيمات النانوية والبكتيريا عن طريق قياس التدفق الخلوي بالتصوير متعدد الأطياف. عند محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر أن المثبطات لها تأثير سام للخلايا.

وبناءً على ذلك، من الضروري إجراء تجارب مسبقة لتحديد ملامح السمية الخلوية لتعيين التركيزات المثلى للاستخدام. ولا تنسَ أن التعامل مع بكتيريا السالمونيلا (salmonella) قد يكون خطيراً، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة وتجنب تكوين الرذاذ الجوي عند تنفيذ هذا الإجراء.