مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مصفوفة مركبة مصنوعة من مواد حيوية طبيعية يمكن استخدامها لتوصيل الخلايا الجذعية وتمايزها للمساعدة في التئام الجروح. ويتم تحقيق ذلك من خلال عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية أو SC أولاً من حيوان تجارب. بعد ذلك، يتم تحميل A SC على كرات شيتوزان مجهرية مُعدة مسبقاً.

بعد ذلك، يتم صب هلام الكولاجين المليء بالليفات (FIBRILLATED collagen gel)، ثم تُوضع حبيبات A-S-C-C-S-M في طبقة فوق هلام الكولاجين. وأخيراً، يتم صب هلام PEG fibrin فوق هلام كولاجين A-S-C-C-S-M، ثم يُضاف الوسط الغذائي. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر الهجرة المتزامنة ثنائية الاتجاه لخلايا A SC من حبيبة CSM إلى كل من مصفوفة الكولاجين ومصفوفة PEG fibrin.

من خلال هذا الإجراء، يمكن لمصدر واحد من الخلايا الجذعية أن يتلقى إشارات تمايز من البيئات الدقيقة المكونة من الكولاجين وPEG fibrin، ويتم تحفيزه بشكل متباين لإنتاج عوامل متعددة التأثيرات وتكوين شبكة من الهياكل الوعائية الأولية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المركبات المكونة من مادة واحدة أو بدائل الجلد منزوعة الخلايا، في أن تلك المنتجات الأخرى لا تعالج بنشاط عملية إعادة التوعي الدموي للمنتج من قبل المضيف. وقد تولدت لدينا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما لاحظنا أن RAD A SE المعزولة لديها الميل للتمايز نحو النمط الظاهري الوعائي عند استزراعها في مصفوفة فيبرين خنزيرية.

أثارت هذه الملاحظة فكرة إمكانية استخدام مصدر واحد للخلايا الجذعية في آن واحد ضمن نظام يتكون من مواد حيوية مختلفة. بعد عزل واستزراع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs)، وتحضير الكرات المجهرية من الشيتوزان (CSMs) وتحميل خلايا ASCs داخل CSMs، يتم تحضير هيدروجيل البولي إيثيلين جليكول والفبرين عن طريق إذابة peg المعدل بـ succinyl glut derate في 4 mL من محلول ملحي منظم بـ tris. وقبل البدء في التجربة مباشرة، يُستخدم مرشح بمسامية 0.22 micron لتعقيم المحلول.

في بئر زراعة من لوحة ذات ستة آبار، اخلط 500 µL من مخزون fibrinogen و 250 µL من مخزون PEG، ثم حضن المزيج لمدة 20 دقيقة في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C. بعد ذلك، اخلط 250 µL من A-S-C-C-S-M المحضر مسبقاً مع محلول fibrinogen المبيجج (pegylated)، ثم أضف فوراً 1 mL من محلول مخزون thrombin، وباستخدام الماصة قم بالتقليب السريع (trituration) مرة أو مرتين، ثم ضع خليط الخلايا والهلام فوراً في لوحة ذات 12 بئراً وحضنه في غرفة مرطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، اغسل peg fibrin الناتج مرتين باستخدام HBSS، ثم حضنه في وسط alpha minimal essential medium مكمل بـ 10% FBS في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C، مع المتابعة باستخدام تقنيات المجهر الضوئي القياسية على مدار فترة زمنية مدتها 11 يوماً.

لاحظ هجرة الخلايا من CSM إلى مزيج الجل، A-S-C-C-S-M مع كولاجين من النوع الأول المستخلص من أوتار ذيل الجرذ باستخدام هيدروكسيد الصوديوم العادي. اضبط pH إلى 6.8 وقم بإجراء التليف (fibrillate). أضف الكولاجين المليف، ومزيج A-S-C-C-S-M إلى طبق يحتوي على 12 بئراً واحضنه في حاضنة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة.

بعد التحقق من اكتمال عملية التليف، تُحضن هلامات collagen A-S-C-C-S-M لمدة تصل إلى 11 يوماً في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. تُمكّن ملاحظة هجرة الخلايا من CSM إلى داخل الهلام على مدار فترة 11 يوماً باستخدام تقنيات المجهر القياسية من تطوير بنية ثنائية الطبقة لدراسة خصائص الهجرة والتحفيز المشترك لمصدر واحد من الخلايا الجذعية باستخدام سقالتين حيويتين.

قم بتحضير كل من هلام الكولاجين وهلام فيبرين PEG مع إجراء التعديلات الطفيفة التالية: حضّر واحد مليليتر من الكولاجين بتركيز 7.5 مليجرام لكل مليليتر. ثم انقل الخليط إلى قطعة إدراج لزراعة الأنسجة مكونة من ستة آبار واحضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد اكتمال عملية التليف، ضع فوق سطح الكولاجين 200 ميكروليتر من A-S-C-C-S-M بتركيز خمسة مليجرام في وسط زراعي.

بعد استقرار الكريات المجهرية فوق الهلام، قم بتحضير هلام PEG fibrin باستخدام 250 µL من وسط استنبات الخلايا. بعد ذلك، ضع طبقة من محلول fibrinogen thrombin المبيجلي (pegylated) فوق طبقات كولاجين A-S-C-C-S-M. وبمجرد الانتهاء، قم بحضن البنى لمدة 30 دقيقة في حاضنة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide لتحقيق التجلط الكامل.

وأخيرًا، ضع 1 mL من الوسط في الحجرة العلوية فوق البنية و 3 mL من الوسط في الحجرة السفلية. وأظهر توصيف خلية جذعية (SC) مغمورة داخل هذه السقالة أن الخلايا الجذعية المحملة في مصفوفات خارج الخلية (CSMs) يمكن أن تتوضع بين طبقة من الكولاجين وطبقة من PEG-fibrin في آن واحد، وتستقبل إشارات من كلتا البيئتين خارج الخلية بشكل متباين لتزدهر في ظل ظروفها الجديدة. وكما هو موضح هنا، دعم الكولاجين قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ASCs) على البقاء كخلايا جذعية، وهو ما ثبت من خلال تعبيرها عن stro-1 باللون الأخضر، بالإضافة إلى شكلها المورفولوجي الشبيه بالأرومات الليفية.

في المقابل، حفز PEG fibrin الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني (ASCs) للتمايز نحو نمط ظاهري غير وعائي، كما يتضح من مورفولوجيتها الشبيهة بالأنابيب الموضحة هنا، والمكتملة بوجود تجويف وتعبيرها المحدد للخلايا البطانية عن عامل von Willebrand الموضح هنا باللون الأحمر. بالإضافة إلى ذلك، وكما هو موضح هنا، بدا أن هذه الأنماط الظاهرية الملحوظة قد ظهرت في مرحلة مبكرة من الزرع وتم الحفاظ عليها على مدار 11 يوماً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهني للجرذان، وتحميلها على الكرات المجهرية من الشيتوزان، ودمجها في هيدروجيل ثنائي الطبقة باستخدام مواد حيوية معتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA).

لا تنسَ أن المواد الحيوية والخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول مشتقة من حيوانات وبشر، ويمكن أن تكون خطيرة للغاية إذا كانت ملوثة بمسببات الأمراض من مضيفاتها. لذا، يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية وتقنيات زراعة الخلايا المعقمة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.