الداخلي للهندسة الرئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج نسيج رئوي في المزرعة يكون قابلاً للمقارنة من الناحية المورفولوجية والفيزيولوجية مع نسيج الرئة الأصلي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استئصال القلب والرئتين من جرذ بالغ. وتتمثل الخطوة التالية في قسطرة الشريان الرئوي والقصبة الهوائية وتوصيل الرئتين المقسطرتين بمفاعل حيوي لإزالة الخلايا.

بعد إزالة الخلايا والشطف، تُنقل الرئة إلى مفاعل حيوي معقم للزراعة ويتم تحضيرها للاستزراع. الخطوة النهائية من الإجراء هي استزراع الجزء المطلوب من الرئة بمجموعة خلوية مُحضرة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر إعادة استيطان المصفوفة خارج الخلوية منزوعة الخلايا بكفاءة بواسطة خلايا تعبر عن مؤشرات رئة محددة إقليمياً من خلال مجهر التألق المناعي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لاستزراع خلايا الرئة في المختبر في أن الخلايا تحافظ على أنماطها الظاهرية المتمايزة لفترة زمنية ممتدة، مما يتيح دراستها لعدة أسابيع ضمن ركيزة ثلاثية الأبعاد مشتقة بيولوجياً. ولإزالة الخلايا، يتم توصيل الرئتين بغطاء المفاعل الحيوي عبر القنية الوعائية، ويتم توصيل الغطاء بجهاز إزالة الخلايا. كما يتم تثبيت الزجاجة الموجودة فوق الرئتين بواسطة حامل حلقي ومشبك مثبت.

في هذه المرحلة، يمكن إزالة المواد الخلوية لإنتاج سِقالة من المصفوفة خارج الخلوية، والتي يمكن إعادة توطينها بالمواد الخلوية. يوضح هذا المخطط تجميع المفاعل الحيوي لاستزراع وزراعة أنسجة الرئة المهندسة. يتصل موصل لور لوك (lure lock) الخاص بالقنية الرغامية بدائرة تنفس تقع بين خزان الرغامي والغرفة الرئيسية.

تتضمن حلقة التنفس صمامين أحاديي الاتجاه، مُوضعَيْن بحيث يسلك الوسط مساراً مختلفاً عند الدخول إلى الرئة والخروج منها. كما تم دمج خزان صغير مؤقتاً في خط التروية لغرض استزراع الخلايا البطانية.

تُستخدم مضخة نبضية لنقل الخلايا من الخزان إلى الحيز الوعائي في الرئة. ويتم توفير التروية الوعائية باستخدام مضخة أسطوانية. يتم تروية الوسط في الشريان الرئوي عبر القنية المتصلة، حيث يتدفق عبر الأوعية الدموية للرئة ويخرج من الوريد الرئوي مباشرة إلى المفاعل الحيوي الرئيسي حيث يتم سحب الوسط من أجل التروية.

يتم تثبيت الظهارة الرئوية عن طريق الحقن في حلقة التنفس. وتُستخدم الغرفة الرئيسية التي تحتوي على الرئة وخزان القصبة الهوائية لاستزراع الرئة لفترات طويلة. وعند استخراج الرئتين وقنطرة الشريان والقصبة الهوائية بشكل صحيح، يجب أن تحتفظ الرئتان المستخرجتان حديثاً بالهواء دون حدوث تسرب.

يمكن التحقق من ذلك عن طريق نفخها بالهواء أثناء غمرها في السائل، حيث يجب ألا تظهر أي فقاعات تشير إلى وجود تسرب للهواء. لبدء البروتوكول، يتم نفخ الرئتين بمحلول PBS يحتوي على نتروبروسيد الصوديوم حتى تمتلئ الرئتان دون أن يتجاوز ذلك حد النفخ المفرط، ثم يتم إغلاق كانيولا الرغامي على الفور لضمان بقاء الرئتين منتفختين.

بعد ذلك، قم بتروية الرئتين بمحلول PBS و SNP لمدة 15 دقيقة على الأقل بضغط 15 millimeters of mercury. بعد ذلك، قم بإزالة السدادة من كانيولا القصبة الهوائية للسماح للرئتين بالتفريغ من الهواء. استمر في التروية بمحلول PBS و SNP لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة إذا لزم الأمر.

أعد ملء المحلول الملحي الموّزن بالفوسفات (PBS) ومحلول SNP لضمان الحفاظ على ضغط التروية عند 10 إلى 15 مليمتر زئبق. لبدء إجراء عملية إزالة الخلايا طويلة الأمد، يتم توصيل غطاء المفاعل الحيوي بجهاز إزالة الخلايا، ثم يتم توصيل الرئتين بالغطاء.

باستخدام وصلات لور لوك (lure lock) المرتبطة بالقنية التي تأخذ شكل حرف Y، يجب توصيل قنية الشريان الرئوي بخط التروية، بينما تترك القنية الرغامية طافية بحرية. ولضمان إزالة الخلايا بالكامل من النسيج، من الضروري منع دخول الهواء إلى النظام. وتساعد الصمامات أحادية الاتجاه الموجودة في القنيتين الشريانية والرغامية على التخلص من فقاعات الهواء في الأنابيب من خلال السماح بتدفق عكسي داخلها.

وبناءً على ذلك، يتم السماح بإزالة الفقاعات الهوائية بواسطة حقنة، لضمان خلو جميع الخطوط من الهواء. ابدأ عملية التروية باستخدام محلول إزالة الخلايا. يتم التروية بمحلول إزالة الخلايا.

حتى يتم تروية الرئتين بـ 500 milliliters من المحلول، يكون الضغط الأمثل أقل من 15 millimeters of mercury. وعادةً ما يتطلب ذلك 2.5 hours. وتكون معدلات التدفق بطيئة جداً في البداية، ثم تزداد بسرعة خلال الساعة الثانية لتصل إلى حوالي one milliliter per minute أو أكثر.

أثناء عملية التروية، قم بإزالة سائل إزالة الخلايا المستخدم من المفاعل الحيوي بشكل دوري، مع التأكد من بقاء كمية كافية من السائل لدعم الرئة والقنية الرغامية. عند اكتمال التروية بسائل إزالة الخلايا، انقل الرئتين والمفاعل الحيوي إلى غطاء زراعة الأنسجة. لبدء شطف العضو، قم بإزالة الوعاء سعة 500 milliliter الذي يحتوي على سائل إزالة الخلايا واستبدله بوعاء معقم يحتوي على ما يصل إلى لتر واحد من PBS المعقم.

استخدم الشفط بالتفريغ أو سرنجة للتأكد من خلو الخطوط من الهواء، ثم قم بتروية PBS عبر الأوعية الدموية بضغط يتراوح بين 10 إلى 15 مليمتر زئبقي بنفس الطريقة. وكما هو الحال في عملية إزالة الخلايا، قم بإزالة PBS العادم من المفاعل الحيوي دورياً باستخدام تقنيات معقمة، ثم استبدل أو أعد ملء وعاء PBS. استمر في الشطف باستخدام PBS معقم وطازج حتى يتم تروية الرئتين بـ 2.5 لتر على الأقل من PBS المعقم.

عادةً ما تستغرق هذه العملية يومين من بداية عملية إزالة الخلايا حتى اكتمال الشطف. يتم نقل الرئتين إلى نظام مفاعل حيوي معقم جديد يحتوي على PBS طازج مضاف إليه 10%FBS و10%Pen strep، مع التأكد من ملء كل من حلقة التروية الكاملة وخطوط الممرات الهوائية بالكامل بالسائل. ومن هذه النقطة فصاعداً، ستُستخدم مضخة نابضة لتروية الرئتين بمعدل خمسة مليمترات في الدقيقة.

قم بتعقيم سِقالة المصفوفة خارج الخلوية للرئة عن طريق التروية طوال الليل باستخدام PBS يحتوي على 10% FBS و10% penicillin streptomycin. بعد إتمام هذه الخطوة، انقل الرئات إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة أو حتى تستقر درجة الحرارة. وتحضيراً للمعالجة بـ Ben Nase، فإن الخطوة التالية هي معالجة الرئات بـ Ben Nase.

لإزالة الحمض النووي المتبقي من كل رئة، ابدأ بملء محقنة واحدة سعة 10 milliliter بمحلول Ben Nase buffer المسخن مسبقاً فقط، ومحقنة أخرى سعة 10 milliliter بتركيز 90 units per milliliter من Ben Nase المخفف في Ben Nase buffer. ثم أوقف عملية تروية الرئتين.

بعد ذلك، قم بنفخ المجرى الهوائي باستخدام محلول Ben Nase المنظم مع تجنب حقن الهواء في الرئة. اترك الرئة لتفرغ من الهواء لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بنفخ الرئة باستخدام محلول Ben Nase.

ومرة أخرى، يجب توخي الحذر لعدم إدخال الهواء إلى الرئة بعد نفخها باستخدام Ben Nase. اترك الرئتين دون تروية أو تهوية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وفي نهاية هذه الساعة، استأنف التروية باستخدام PBS مضافاً إليه 10%FBS و10%penicillin streptomycin الموجود مسبقاً في المفاعل الحيوي، وواصل التروية طوال الليل حتى اليوم التالي.

بعد الشطف والتعقيم، يمكن تحضير سِقالة المصفوفة خارج الخلوية الطويلة لإعادة التوطين الخلوي. استبدل محلول P-B-S-F-B-S benzo بـ 250 milliliters من وسط الزراعة. قم بإجراء التروية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إدخال الخلايا، واستبدله بوسط زراعة جديد مباشرة قبل استزراع الخلايا.

يمكن الاستفادة من العديد من المصادر الخلوية لإعادة بناء الأعضاء. هنا، سيتم توضيح عملية الزرع باستخدام مجموعة من الخلايا الطلائية. أولاً، قم بتحضير حقنة تحتوي على 15 milliliters من معلق خلوي لمجموعة الخلايا الطلائية المطلوبة.

بعد ذلك، املأ خزان المجرى الهوائي بـ 80 milliliters من وسط الزرع وتأكد من خلو جميع خطوط التهوية من الهواء. ثم ضع المفاعل الحيوي في حاضنة زراعة أنسجة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وقم بتوصيل مضخة الحقنة للتهوية. استزرق الخلايا في الرئتين باستخدام دفعة واحدة سريعة عن طريق حقن 15 milliliter من معلق الخلايا في القنية الرغامية.

تأكد من إغلاق مرشحات الهواء في المفاعل الحيوي الرئيسي. ثم ابدأ على الفور بعملية سحب بطيئة واحدة باستخدام مضخة المحقنة لسحب 60 milliliters من الهواء من المفاعل الحيوي الرئيسي بمعدل ثلاثة milliliters في الدقيقة. ستستغرق هذه العملية 20 دقيقة تقريبًا.

اترك الرئتين في حالة سكون لمدة 18 ساعة تقريباً بعد ذلك. ابدأ بالتروية الوعائية البطيئة بمعدل 0.5 milliliters per minute تقريباً. وخلال استزراع العضو، تُجرى التروية عادةً بمعدل من واحد إلى ثلاثة milliliters per minute.

عند استخدام مضخة أسطوانية خلال زراعة الخلايا الطلائية، يتم توفير التهوية عادةً بمعدل مستمر يبلغ نفساً واحداً في الدقيقة وبحجم مدي يتراوح من 5 إلى 10 milliliters. أما عند استخدام مضخة حقنة، فيتم سحب الهواء وحقنه بشكل دوري في المفاعل الحيوي لمحاكاة عملية التنفس من خلال التناوب بين الضغط السلبي والضغط الجوي داخل الغرفة الرئيسية. ونظراً للحاجة إلى الحفاظ على إحكام غلق المفاعل الحيوي أثناء التهوية، يجب إيقاف التهوية يومياً واستبدال الهواء الموجود في الغرفة الرئيسية.

بالإضافة إلى ذلك، يجب تغيير الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام تقريبًا. وأثناء الزراعة، ينبغي استبدال نصف الحجم الإجمالي تقريبًا في كل مرة عند زراعة الظهارة الرئوية والبطانة الوعائية. ومن خلال السقالة المثبتة داخل المفاعل الحيوي، تمكنا من توليد نسيج رئوي قادر على المشاركة في تبادل الغازات لفترات زمنية قصيرة.

يظهر هنا صبغ هيماتوكسيلين وإيوزين قياسي لرئة جرذ طبيعية للمقارنة مع صبغ H and E لرئة جرذ منزوعة الخلايا. يجب أن تكون المصفوفة خارج الخلوية المنزوعة الخلايا في النهاية خالية تماماً من المواد الخلوية، مع الاحتفاظ بالخصائص العيانية والمجهرية والبنيوية الدقيقة للرئة الطبيعية. سيتيح صبغ h and e رؤية أي DNA متبقٍ ملتصق بالسقالة نتيجة لعدم كفاية عملية نزع الخلايا أو الشطف، وهي ظروف مثالية لاستزراع الخلايا والزراعة اللاحقة للرئة.

ويجب أن ينتج عن المفاعل الحيوي توزيع جيد للخلايا ضمن الفصوص الخمسة للرئة، كما ينبغي أن يوفر تغطية تبلغ حوالي 70% من سِقالة المصفوفة خارج الخلوية. وتقارن هذه الصور بين الرئة الأصلية والرئة المعاد استيطانها عند صبغها بالفلورة المناعية. وبالنسبة لعلامات الرئة الرئيسية، فإن التجمع الخلوي المستنبت يكون إيجابياً لبروتين الإفراز في خلايا Clara والبروتين الإفرازي C وAquaporin five.

تظهر العلامات المراد دراستها باللون الأحمر، بينما تظهر النوى المصبوغة بـ DAPI باللون الأزرق في جميع اللوحات. وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إتمام العملية من إزالة الخلايا وحتى التراجع في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح.