إلى الوراء تحميل من الأعصاب، ومساحات، وجذور العمود الفقري مع الأصباغ الفلورية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال تركيز عالٍ من صبغة فلورية أو صبغة حساسة للأيونات إلى العصبونات أو أي مسار عصبي باستخدام تقنية بسيطة ومنخفضة التكلفة. ويتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج نوعين من الماصات أولاً، النوع الأول والنوع الثاني. ثم يتم توصيل أنبوب مطاطي مرن بالماصة من النوع الأول وتطبيق ضغط إيجابي لسحب المسار العصبي المستهدف إلى الماصة من النوع الأول، مع التحقق من إحكام السدادة.

بعد ذلك، أدخل الماصة من النوع الثاني في الماصة من النوع الأول، واستخدم الماصة من النوع الثاني لسحب ما تبقى من A CSF من الماصة من النوع one. ثم أضف الصبغة إلى الماصة من النوع الأول، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هوائية. والخطوة النهائية هي تحضين الخلايا العصبية في الظلام لمدة تتراوح بين 6 إلى 20 ساعة.

وفي النهاية، بعد إزالة الماصة من النوع الأول، يصبح التحضير جاهزاً للدراسات المورفولوجية، أو الفيزيولوجية الكهربائية، أو الدراسات في المختبر (in vitro). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التطبيق في الحمام، أو الحقن في ساق الدماغ (BOS injection)، أو التثقيب الكهربائي، في أن مادة D يتم توصيلها إلى مجموعة عصبونية محددة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علوم الأعصاب، مثل النشاط، والترابط، والمورفولوجيا، وتوزيع عصبونات محددة.

بشكل عام، تتطلب هذه التقنية التدريب، لا سيما لضمان عدم تخفيف الصبغة داخل الماصة من النوع الأول وعدم إدخال فقاعات هوائية فيها. ابدأ هذا الإجراء بسحب أنبوب البولي إيثيلين فوق لهب مصباح كحولي لإنتاج ماصتين قصيرتين بنهايات مدببة. أولاً، اسحب ماصة قصيرة من النوع الأول ذات طرف صغير يمكنه تثبيت الجذر أو المسار المستهدف بإحكام.

بعد ذلك، اسحب ماصة من النوع الثاني ذات عمود أطول وأرفع وطرف دقيق للغاية يمكن إدخاله في الماصة من النوع الأول وصولاً إلى طرفها. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة من النوع الثاني بإبرة مقاس 19 gauge مثبتة بـ EC. ثم ضع النخاع الشوكي المعزول في حمام.

قم بدمجه مع A CSF المبرد طوال عملية التحميل. بعد ذلك، ضع الماصة من النوع الأول على حامل قطب كهربائي بحيث يمكن توصيل فتحتها الخلفية بسهولة بمحقنة عبر أنبوب مرن. في هذا الإجراء، اسحب أولاً A CSF إلى الماصة من النوع الأول باستخدام محقنة.

بعد ذلك، قم برسم المسار المحوري أو الجذر المراد ملؤه. ثم قم بإزالة الأنبوب المرن من الفتحة الخلفية. بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة من النوع الثاني بمحقنة أخرى.

أدخلها في الماصة من النوع الأول، التي تثبت سبيلاً محورياً أو جذراً عصبياً تحت المجهر. استخدم السرنجة المتصلة بالماصة من النوع الثاني لسحب السائل الدماغي الشوكي (A CSF) بحيث يغطي السائل الدماغي الشوكي (A CSF) المتبقي السبيلاً المحوري فقط. ثم اسحب الماصة من النوع الثاني من الماصة من النوع الأول.

راقب مستوى A CSF لبضع دقائق للتحقق من وجود سدادة جيدة على المسلك المحوري أو الأعصاب. بعد ذلك، أذب الصبغة في A CSF أو 0.2%Triton X 100 في ماء مقطر مزدوج. اسحب المحلول إلى الماصة من النوع الثاني عن طريق تطبيق ضغط سلبي ضعيف على المحقنة المتصلة، مع الحرص على عدم سحب أي فقاعات هوائية.

بعد ذلك، أدخل ماصة النوع الثاني التي تحتوي على الصبغة في محلول A CSF المتبقي في ماصة النوع الأول، ثم حرر الصبغة ببطء داخل A CSF باستخدام ضغط إيجابي خفيف عبر المحقنة. تأكد من عدم إدخال أي فقاعات هوائية أو التسبب في إزاحة النسيج المستهدف من داخل طرف الماصة. في حالة دخول فقاعة هوائية إلى ماصة النوع الأول أثناء حقن الصبغة، قم بسحب الفقاعة للخارج عن طريق تقريب طرف ماصة النوع الثاني من الفقاعة، ثم تطبيق ضغط سلبي ضعيف برفق باستخدام المحقنة الملحقة.

بعد تحرر كمية كافية من الصبغة، اسحب الماصة من النوع الثاني. بعد ذلك، قم بتحضين النسيج في الظلام لمدة تتراوح من 6 إلى 20 ساعة، وذلك اعتماداً على نوع التجربة. وبمجرد السماح بمرور وقت كافٍ للامتلاء، اسحب القطب الكهربائي برفق من النسيج.

بعد ذلك، تصبح الأنسجة جاهزة للتصوير أو الفحص النسيجي. يوضح المخطط التوضيحي التالي عملية تحميل ثلاثة صبغات فلورية مختلفة من الديكستران مقترنة في آن واحد في العصبونات الحركية، والعصبونات الحسية الواردة، والعصبونات البينية الشوكية؛ حيث تم ملء العصبونات الحركية والعصبونات الحسية الواردة العجزية عكسياً باستخدام Cascade blue Dextran و Texas red dextran عبر الجذور البطنية والظهرية على التوالي. بينما تم تحميل Green fluorescent dextran في العصبونات البينية الشوكية التي تصعد محاويرها عبر الحبل البطني.

تظهر هنا صورة مجهرية بؤرية (confocal) لمقطع من النخاع الشوكي العجزي حيث تم وسم العصبونات تراجعيًا. يلاحظ أن الألياف الحسية الواردة الموسومة توجد بشكل أساسي في الجانب المماثل (ipsilateral). ومع وجود عدد قليل من الإسقاطات في الجانب المقابل، تكون العصبونات الحركية الموسومة في الجانب المماثل للجذر البطني المملوء، بينما تكون العصبونات البينية الموسومة في الجانب المقابل له كما يشير رأس السهم.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق إضافية للإجابة على أسئلة جوهرية مثل الاتصالية الوظيفية، والتوازن بين الاستثارة والتثبيط، ونوع الجيوب، والتوزيع، وإنتاج النواقل العصبية في عصبونات الحقل DI. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفسيولوجيا العصبية للنخاع الشوكي وجذع الدماغ لعزل مجموعات عصبونية محددة باستخدام الصبغات الحساسة للأيونات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق الصبغات الفلورية و/أو الصبغات الحساسة للأيونات في العصبونات والألياف الحسية في النخاع الشوكي المعزول.