عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتعيين مواقع التوقف الترجمي الرئيسية لـ mRNA تم ترجمته في نظام ترجمة خالٍ من الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استنساخ الجين المستهدف تحت تحكم محفز نسخ T7. بعد ذلك، يتم نسخ mRNA وتنقيته.

بعد ذلك، يتم إجراء الترجمة في المختبر (in vitro translation) بوجود mRNA وأحماض أمينية مشعة لوسم البروتين المُصنَّع والببتيدات المتعددة الناشئة. وأخيراً، يتم عزل البوليسومات باستخدام طرد مركزي بسرعات الترسيب، ثم تُفصل السلاسل الناشئة المعزولة عن طريق الفصل الكهربائي للهلام. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر ببتيدات متعددة ناشئة بأطوال مختلفة بواسطة Tristine SDS page والتصوير الشعاعي الذاتي، مما يشير إلى وجود مواقع توقف على طول mRNA المستهدف.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرقنا الحالية، مثل مقايسة حماية النواة الكوكية الدقيقة (micro cocal nucleus protection assay)، في كونها بسيطة وسريعة وفعالة للغاية، كما أنها تتيح تحديد وتعيين مواقع الترجمة الرئيسية على طول أي MNA في نظام مخاطر خلوي معين. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة الجوهرية في مجال الترجمة وطي البروتين الترجمي، مثل كيفية تأثير العوامل الصحية، كاستخدام المخروط، أو وفرة TNA، أو البنية الثانوية لـ mRNA، على حركية الترجمة. وعلاوة على ذلك، قد تساهم هذه الطريقة في تعزيز فهمنا للعلاقات بين حركية الترجمة والخطوات الرئيسية في مسار طي البروتين أثناء ترجمة الشفرة.

تمتد آثار هذه التقنية نحو فهم عملية طي البروتين داخل الجسم الحي (in vivo)، والتي يُعتقد على نطاق واسع أنها تحدث بشكل متزامن مع عملية الترجمة على الريبوسوم، على الرغم من أن الدراسة الحالية تتضمن ترجمة خالية من الخلايا لبروتين gamma bicrystalline باستخدام مستخلص خلوي متاح تجاريًا. يمكن تطبيق هذه التقنية أيضًا لتحديد العناصر المحددة للترجمة (translational IDE) في أي بروتين محتمل باستخدام مستخلص قادر على الترجمة تم تحضيره من أي مصدر خلوي. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في خطوتين رئيسيتين من البروتوكول.

يتمثل الأمر الأول في تحديد الوقت الإجمالي المطلوب لإجراء تفاعل الترجمة، مما يضمن بقاء غالبية بولي ببتيدات nascent مرتبطة بالريبوسوم. أما الأمر الثاني فهو إيجاد نظام فصل مناسب لفصل غالبية بولي ببتيدات nascent، حيث يعتمد اختيار نظام الفصل على حجم البروتين قيد الدراسة. لقد راودتنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا دراسة حركية الترجمة لجزيئات globin في منتصف الثمانينيات، وذلك فيما يتعلق بالنموذج المقترح لطي الترجمة COT لـ globin.

لوحظ عدم انتظام ترجمة الجلوبين لأول مرة بواسطة PRO وMaurice في عام 1974 عند استخدام كروماتوغرافيا CLO ذات الإغلاق الحجمي لسلاسل NAS والجلوبين. ومع ذلك، لم يمتلك تحليلهم الدقة المطلوبة، حيث لاحظ Pro وmore أربعة مواقع قوة ترجمة رئيسية أثناء ترجمة الجلوبين. لاحقاً، سمح تحليلنا بالكشف عن حوالي 10 مواقع قوة إضافية وبناء نموذج مفصل لطي الجلوبين الترجمي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث تتضمن التقنية الموصوفة هنا عزل البوليسوم وتحليل الببتيد المتعدد الناشئ باستخدام هلام Tri S Ds page.

تعد كلتا هاتين الخطوتين ضروريتين للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار. سيقوم طالب دراسات عليا من مختبر Myelo Sujata بتوضيح البروتوكول الخاص بالنسخ المختبري للحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA). ابدأ بجين مستهدف تم استنساخه تحت محفز T7 و/أو SP6، وباستخدام إنزيم قطع مناسب، قم بكسر خطية قالب DNA في اتجاه المصب من كودون التوقف و/أو الطرف '3 لـ mRNA.

يتم إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز لعينة من الهضم التقييدي للتحقق من أن الـ DNA قد تم تحويله بالكامل إلى شكل خطي. بعد تحديد التركيز الأمثل لقالب الـ DNA، استخدم طقم نسخ لنقل الـ DNA إلى mRNA مخبرياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، استخدم ترسيب كلوريد الليثيوم لتنقية الـ mRNA.

ثم استخدم الرحلان الكهربائي لهلام الأكريلاميد أو rhos للتحقق من نقاوته. قم بتحضير تفاعل ترجمة في المختبر بحجم 100 µL في ماء خالٍ من النيوكلياز عن طريق إضافة خليط من الأحماض الأمينية بتركيز 1 mM بدون ميثيونين، و10 وحدات من مثبط RNA، و20 micro curies من الميثيونين المشع 35 S، ومستخلص الخلايا الشبكية للأرنب. بعد ذلك، قم بتدفئة التفاعل مسبقاً عن طريق تحضينه عند 30 °C لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، أضف 2 µg من mRNA وحضنه عند 30 °C لمدة خمس دقائق لإيقاف التفاعل، ثم وضعه على الثلج لعزل متعددات الببتيد الناشئة المرتبطة بالريبوسومات. ضع تفاعل الترجمة في طبقة فوق 4.5 mL من glycerol بتركيز 30% في tris HCL بتركيز pH 7.6 مع potassium chloride وmagnesium chloride باستخدام جهاز طرد مركزي بدوار TLA 110 عند 100,000 ×g لمدة ساعة واحدة عند 4 °C. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي بعناية، ثم أعد تعليق الراسب البوليسومي الذي يحتوي على متعددات الببتيد الناشئة في حجم صغير من tris, HCL buffer بتركيز 1 mM وpH 7.6 يحتوي على 0.5 mg/mL من ribonuclease A، وحضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

لتعزيز التحلل المائي للببتيد، ورابطة TRNA Esther، أضف هيدروكسيد الصوديوم بتركيز نهائي قدره 10 millimolar إلى التفاعل واتركه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إضافية. قم بفصل متعدد الببتيد الناشئة باستخدام tris tri SDS page، ثم قم بتثبيت الهلامات وتجفيفها. أخضع الهلامات للتصوير الشعاعي الذاتي، يليه التصوير الفسفوري للكشف عن متعدد الببتيد الناشئة.

يجب أن تؤدي حركة الريبوسوم المتغيرة الناتجة عن التغيرات في مجموعة tRNA إلى تغييرات في توزيع أحجام الببتيدات المتعددة الناشئة التي تتراكم أثناء عملية الترجمة، بالإضافة إلى شدتها النسبية التي تعكس مدة التوقف عند هذه النقطة. تم عزل الببتيدات المتعددة الناشئة لبروتين gamma B crystalline وفصلها باستخدام تقنية Tristine SDS page. وتشير الأطوال والشدات غير المتطابقة للببتيدات المتعددة في نظامي RRL و e coli إلى أن حركة الريبوسومات على طول mRNA في هذين النظامين تتبع حركية ترجمة مختلفة.

على سبيل المثال، لاحظ الحزمة البارزة بوزن 17.7 kilodalton في محلل e coli والتي لا تظهر في نظام محلل خلايا الشبكية للأرانب. يحتوي Gamma B crystalline على كودونات أرجينين ترادفية تتكرر في الأنظمة الثديية، ولكن من المعروف أنها نادرة للغاية وتُترجم ببطء في e coli، مما يشير إلى أن هذه الحزمة ناتجة عن توقف الريبوسوم عند هذه الكودونات النادرة الترادفية كما هو موضح هنا.

لا يمكن ملاحظة أي حزم في حالة غياب mRNA، كما أن المعالجة بـ pur mycin تزيل معظم السلاسل الناشئة من polysome. بالإضافة إلى ذلك، فإن المعالجة المطولة بـ pur mycin تزيل جميع السلاسل الناشئة، مما يؤكد أن نواتج البولي ببتيد الملحوظة هي سلاسل ناشئة مرتبطة بالريبوسوم وليست MRPs تترسب بشكل مشترك مع polysome. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون يوم إلى يومين. وتعتمد مدة الإجراء بشكل أساسي على مدة خطوة الطرد المركزي وخطوة الفصل الكهربائي لهلام الببتيد الناشئ.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيقاف تفاعل الترجمة فوراً بعد انتهاء وقت الحضن. ولتجنب تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم، من الضروري جداً تجنب وصول أي RNAs في أي خطوة. إذ يمكن أن يؤثر تلوث RNAs على كفاءة الترجمة في المستخلص ويؤدي إلى تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم عند اتباع هذا الإجراء.

كما يمكن اختبار أهداف أخرى بعد تطوير هذه التقنية، مثل تأثير البروتينات المرتبطة بـ mRNA على كفاءة حركة الريبوسوم على رسالة معينة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طي البروتين لاستكشاف دور توقف الترجمة الناتج عن وجود شفرات نادرة في طي البروتين الترجمي. كما استُخدمت هذه التقنية سابقاً لاختبار دور استبدالات kaon على حركة الريبوسوم على الرسالة وطي البروتين الترجمي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مواقع قوة الترجمة في mRNA المقدم عن طريق عزل الببتيد المتعدد nascent المرتبط بالريبوسوم. لا تنسَ أن العمل مع النظائر المشعة والأحماض الأمينية الموصومة، مثل A 35 methionine على سبيل المثال، يتطلب احتياطات خاصة ويجب مراعاتها دائمًا عند تنفيذ هذا الإجراء.