باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل معقدات السلسلة الناشئة المرتبطة بالريبوسومات 70s والمستقرة بـ SEC TED، أو ما يُعرف بـ RNCs، والتي يتم إنتاجها أثناء عملية الترجمة في نظام خلوي خارج الجسم (in vitro). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إدخال تسلسل إيقاف SEC M بطول 17 حمضاً أمينياً إلى النهاية الطرفية الكربوكسيلية (C terminal) للجين المستهدف، واستنساخه في اتجاه المصب من محفز النسخ T seven. بعد ذلك، يتم نسخ mRNA باستخدام تفاعل نسخ خارج الجسم، ثم يتم تنقيته.

بعد ذلك، يتم ترجمة mRNA المنقى في نظام مستخلص S 30 لـ E coli باستخدام أحماض أمينية مشعة لوسم البروتين المُصنّع أو الببتيد المتعدد السلاسل الناشئ. وأخيرًا، يتم عزل معقدات السلاسل الناشئة المرتبطة بالريبوسوم Mr.Ed الثانية عن طريق الطرد المركزي بالتدرج السكروزي والتجزئة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر أن السلاسل الناشئة مرتبطة بشكل مستقر بالريبوسوم 70 s من خلال تحليل الرحلان الكهربائي للهلام للببتيدات المتعددة السلاسل الموسومة والمعزولة من أجزاء التدرج.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام mRNA الذي يفتقر إلى كودون التوقف، في أنها تضمن بكفاءة عالية ارتباط سلسلة الببتيد المتعددة الناشئة بريبوزوم 70 s أثناء عملية الترجمة وخطوة الطرد المركزي اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك، وبخلاف تقنية غياب كودون التوقف، يمكن استخدام هذه الطريقة بكفاءة متساوية تقريبًا في كل من الأنظمة المختبرية (in vitro) والأنظمة الحية (in vivo). ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال طي البروتين الترجمي، مثل التحديد المبكر للمرحلة التي قد تتشكل فيها وسائط طي ترجمية مختلفة، كما تساعد في تحليل بنيتها باستخدام طرق تحليل البنية المباشرة أو غير المباشرة.

طرق السبر والتحديد يمكن أن تساعدنا هذه التقنية في فك رموز مسار طي البروتين على الريبوسوم. في هذا البروتوكول، وصفنا عزل السلاسل الناشئة لبروتين bine gamma B البلوري كامل الطول المرتبط بالريبوسوم 70 s. ولكن يمكن استخدام هذه التقنية لعزل مختلف أنواع أي بروتين محل اهتمام تقريباً.

يمكن أيضاً اعتماد هذه الاستراتيجية لعزل سلاسل ببتيد natin المبتورة من derm Es. وبوجه عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة خلال خطوة الطرد المركزي بتدرج السكروز، ومع ذلك، لا ينبغي أن يمثل ذلك مشكلة للمتخصصين ذوي الخبرة. وقد قررنا استخدام تسلسل توقف ثانٍ لعزل ببتيدات gamma B crystalline الناشئة المرتبطة بالريبوسوم 70S بعد محاولات أولية أقل نجاحاً تضمنت استخدام mRNA يفتقر إلى كودون التوقف.

لم تتمكن التقنية اللاحقة من ضمان استقرار معقدات السلسلة الناشئة من الريبوسوم (RNCs) خلال خطوات الطرد المركزي اللاحقة بنفس كفاءة التقنية التي تتضمن استخدام تسلسل توقف SECM. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن الخطوات المتعلقة بتحضير التدرج وفصل RNC قد تكون صعبة التعلم، وتتطلب مستوى معيناً من الخبرة لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار. وسيقوم طالب دراسات عليا من مختبري بشرح هذه الخطوات لإجراء عملية النسخ والترجمة في المختبر (in vitro). ابدأ بجين مستهدف تم استنساخه في أي بلازميد يعتمد على T7 و/أو SP6 لتوليد معقدات السلسلة الناشئة من الريبوسوم أو RNCs.

قم بتمديد الطرف الكربوكسيلي (C terminus) للعديد الببتيدي المستهدف عن طريق إضافة تسلسل تحفيز التوقف من M لضمان بروز قطعة العديد الببتيد خارج النفق الريبوسومي. أضف رابطاً مرناً غنياً بالجلايسين وسيرين بين البروتين وتسلسل توقف SEC M للتحضير لعملية النسخ في المختبر، واستخدم إنزيماً قاطعاً يقطع في اتجاه المصب من إطار القراءة المفتوح لخطية الحمض النووي القالب، ثم قم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام AROS للتحقق من الهضم الكامل للعينة. بعد التحقق من التركيز الأمثل للحمض النووي، استخدم طقم نسخ عالي الإنتاجية وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة لتخليق الحمض النووي الريبوزي المرسال.

استخدم ترسيب كلوريد الليثيوم لتنقية الـ mRNA. ثم قم بتشغيل عينة على هلام أكريلاميد أو هلام aros للتحقق من نقاوته. وذلك لأغراض الترجمة المختبرية.

باستخدام نظام e coli في ماء خالٍ من النوكلياز، أضف خليط أحماض أمينية بتركيز 1 mM بدون ميثيونين، و10 وحدات من مثبط الريبونوكلياز، و20 µCi من 35 S methionine، و20 µL من خليط التفاعل، و24 µL من منظم إعادة التشكيل (reconstitution buffer)، و24 µL من مستخلص e coli. قم بتدفئة التفاعل مسبقاً عن طريق تحضينه عند 30 °C لمدة خمس دقائق. ثم أضف من 1 إلى 2 µg من mRNA وحضنه لمدة إضافية تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة عند 30 °C.

أوقف التفاعل بوضعه على الثلج لعزل معقدات السلاسل الناشئة المرتبطة بالريبوسوم 70 s أو ncs. ضع تفاعل الترجمة في طبقة فوق 4.5 milliliters من تدرج سكروز بنسبة 5 إلى 30% في 20 millimolar HEPES، وهيدروكسيد البوتاسيوم pH 7.5، و15 millimolar مغنيسيوم، و100 millimolar خلات البوتاسيوم، و1 millimolar DTT. قم بالطرد المركزي بسرعة 41,000 RPM لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. بعد الطرد المركزي، قم بتجزئة تدرج السكروز باستخدام نظام تدرج كثافة قابل للبرمجة وكاشف امتصاص مضبوط عند 254 nanometers.

اجمع الأجزاء التي تحتوي على الريبوسومات 70 s لإجراء مزيد من التحليل لتحديد ما إذا كان البروتين الممتد SEC M لا يزال مرتبطاً بالريبوسوم 70 s. قم بترسيب البروتين في كل جزء من التدرج عن طريق إضافة حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك. حضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، وفي اليوم التالي، قم بطرد العينات مركزياً عند 14,000 ×g لمدة 15 دقيقة لترسيب البروتين، ثم اغسل الرواسب بنسبة 4:1 من الأسيتون إلى 1 mM tris, HCL pH 7.6.

يُجفف الكريات بالهواء، ثم يُعاد تعليقها في محلول تحميل SDS page. تُفصل العينات بواسطة tris Trice SDS page، ثم تُثبت الجيلات وتُجفف وتُخضع للتصوير الشعاعي الذاتي والتصوير الفسفوري كما هو موضح هنا. بعد الترجمة في المختبر، تم عزل الريبوسومات 70 S عن طريق طرد مركزي بتدرج السكروز وتجزئتها لضمان بقاء بروتين gamma B البلوري مرتبطاً بشكل مستقر بالريبوسوم.

تم تجميع الكسور التي تحتوي على 70 s، وإزالة الأملاح منها، واستبدال المنظم، ثم إخضاعها لجولة إضافية من الطرد المركزي بالتدرج السكروزي. تشير النتائج المعروضة هنا إلى أن SEC M يمكن أن يحفز بكفاءة التوقف الترجمي لـ RNCs الخاصة بالكريستالين gamma B. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في يوم عمل واحد، باستثناء تحليل الرحلان الكهربائي للهلام للسلسلة الناشئة، والذي يتضمن عادةً خطوة ترسيب TCA طوال الليل.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من الضروري للغاية تجنب تلوث RNAs في جميع الخطوات. فقد يؤثر تلوث RNS على كفاءة الترجمة للمستخلص ويؤدي إلى تحرر الببتيد المتعدد الناشئ من الريبوسوم 70S. باتباع هذا الإجراء، يمكن الحصول على NAST وببتيدات متعددة ذات أطوال محددة مسبقاً مرتبطة بشكل مستقر بالريبوسوم 70S، وذلك بناءً على الهدف النهائي.

يمكن استخدام هذه المعقدات لأغراض متنوعة مثل تحديد بنية السلاسل الناشئة المرتبطة بالريبوسوم باستخدام طرق مباشرة وغير مباشرة مثل NMR أو FRET، أو اختبار ارتباط العوامل والربيطات بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية وطي البروتين لاستكشاف بنية البروتينات كاملة الطول المرتبطة بالريبوسوم، بالإضافة إلى وسائط الطي المزامنة للترجمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وعزل ببتيد متعدد ناشئ، مرتبط بشكل مستقر بريبوسوم 70 s، والذي يمكن استخدامه لاحقاً للإجابة على تساؤلات متنوعة في مجال طي البروتين الترجمي.

لا تنسَ أن العمل مع النظائر المشعة والأحماض الأمينية الموّسمة، مثل A 35 methionine على سبيل المثال، يتطلب احتياطات خاصة ويجب مراعاتها دائمًا عند تنفيذ هذا الإجراء.