تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

سلالة Lyco سالبة الاتجاه، الفيروسات ذات الحمض النووي الريبوزي RNA. يتم تعبئة جينوم فيروسات الإنفلونزا على شكل معقدات بروتينية نووية ريبوزومية فيروسية، أو VR nps، حيث يتم تغليف الجينوم أحادي السلسلة بواسطة البروتين النووي ويرتبط بمعقد بوليميراز turmeric المكون من الوحدات الفرعية PA و PB one و PB two. لتنقية المعقدات السليمة من الخلايا الثديية المصابة، يتم تحضين خلايا Hela مع فيروس إنفلونزا مأشوب موسوم بـ strept.

بمجرد دخول الفيروس إلى الخلايا، يتم تصنيع الـ RNA الفيروسي في النوى عقب العدوى، ثم يتم تحليل الخلايا باستخدام منظف وفصلها إلى كسور سيتوبلازمية ونووية وكسور كروماتين باستخدام الطرد المركزي وبروتوكول فصل الكروماتين القائم على الملح. وأخيرًا، يتم تنقية الـ VRPs ذات الوسم strept بالترشيح التقاربي من كل كسر. ويظهر تحليل تكوين البروتين والـ RNA لـ VR NPS المنقاة عن طريق صبغ الفضة أن استخدام هذا البروتوكول يتيح عزل الـ VRPs المرتبطة بالكروماتين بإحكام وهي سليمة. لذا، فإن إحدى المزايا الرئيسية لبروتوكولنا مقارنة بالطرق القياسية للتنقية التقاربية لمعقدات البروتين النووي الريبوزي لفيروس الإنفلونزا هي أنه من خلال استخدام طريقتنا، يمكن تنقية VR NPS من كروماتين الخلايا المصابة، وهو الموقع المعروف لتصنيع mRNA لفيروس الإنفلونزا.

لذا يمكن استخدام طريقتنا للإجابة على التساؤلات المتعلقة بتنظيم التضاعف والنسخ الفيروسي، مثل تحديد العوامل الفيروسية أو الخلوية، وكذلك التعديلات ما بعد الترجمية اللازمة، على سبيل المثال، لتخليق mRNA الفيروسي أو تخليق RNA الجينومي الفيروسي. وقد يواجه الباحثون الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تجزئة النواة تكون حساسة للغاية للظروف الكيميائية الحيوية، كما يمكن أن تختلف بشكل كبير بين الخطوط الخلوية المختلفة. ابدأ هذا البروتوكول باستخدام خلايا heal التي تم إصابتها بفيروس الإنفلونزا RWSN PB two strep، والذي يحتوي على strep tag مدمج جينياً في الطرف C لـ PB two subunit بمعدل إصابة قدره 3.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بارد، ثم أضف 12 milliliters من PBS البارد وانقل الخلايا من الطبق باستخدام كاشطة مطاطية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي.

يتمثل الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في بروتوكول تجزئة الخلايا؛ فنوى الخلايا حساسة للغاية لعمليات التجانس والخلط، وإذا نُفذت هذه العمليات بشكل غير صحيح، فقد تؤدي بسهولة إلى إتلاف مستخلص الكروماتين. لذا، من المهم جداً اتباع تقنيات التجانس بدقة، بالإضافة إلى اتباع الإرشادات العامة للتعامل مع المحللات الخلوية كما سنوضح هنا.

بعد عملية الطرد المركزي للرواسب، والـ PBS، والـ Resus، قم بتعليق كتلة الخلايا في 10 milliliters من محلول السكروز المنظم البارد. قم بتثبيت طرف ماصة سعة 200 microliter على ماصة مصل بلاستيكية سعة 10 milliliters ومرر الخلايا من خلالها لتفتيت تكتلات الخلايا. قم بحضن المعلق على الثلج لمدة 10 دقائق.

قلب الخلايا دورياً وببطء لإعادة تعليقها. بعد ذلك، أضف non IET P 40 ليصل التركيز النهائي إلى 0.5% وقم بالرج باستخدام جهاز vortex بسرعة عالية لمدة 15 ثانية، ثم قم بالطرد المركزي فوراً لمدة 10 دقائق عند 3,500 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي. بعد عملية الدوران، قم بإزالة السائل الطافي وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.

يُحفظ السائل الطافي عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. يمثل هذا الجزء السيتوبلازمي. يجب أن يكون الراسب أصغر حجماً وأكثر بياضاً من راسب الخلايا الأصلي كما هو موضح هنا.

إذا كان سيتم استكمال البروتوكول في وقت لاحق، يتم تخزين كريّة الخلايا عند درجة حرارة 4 °C. خلاف ذلك، يتم الاستمرار بغسل الكريّة في 5 mL من محلول السكروز المنظم البارد، والطرد المركزي كما سبق. وبمجرد اكتمال عملية الدوران، يتم التخلص من السائل الطافي وإعادة تعليق الكريّة، التي تحتوي على النوى، في 1.5 mL من محلول استخلاص البلازما النووية البارد.

انقل الراسب المعاد تعليقه إلى مجانس زجاجي مبرد سعة 4 مل مزود بمدقة محكمة الإغلاق، وقم بتجنيس النوى بإجراء 20 حركة. مع تجنب تكون الرغوة، يجب أن تزداد المقاومة بعد حوالي 10 حركات. وللتأكد من كفاءة التجنيس، افحص العينة باستخدام مجهر تباين الأطوار.

يجب ألا تعود النوى مستديرة، بل يجب أن تتخذ أشكالاً غير منتظمة وتبدو كما لو كانت قد انفجرت. بمجرد تجانس النوى، انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. قم بحضن المتجانس على عجلة دوارة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 16,000 ×g في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. وبعد انتهاء الدوران، يتم نقل السائل العلوي، وهو جزء البلازما النووية، إلى أنبوب سعة 1.5 ml، ويُحفظ عند درجة حرارة 4 °C. ثم يتم إعادة تعليق الراسب في 1.5 ml من محلول الهضم المنظم الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 37 °C.

بعد ذلك، يتم تحضين الجزء لمدة 10 دقائق عند 37 °C. ثم أضف 42 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 5 M لتصل التركيز النهائي لكلوريد الصوديوم إلى 150 mM، ثم يتم التحضين لمدة 20 دقيقة على الثلج. يتم إجراء الطرد المركزي عند 16,000 ×g في جهاز طرد مركزي دقيق عند 4 °C لمدة 10 دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الراشح وتخزينه عند درجة حرارة 4 °C. يمثل هذا جزء CH one 50. أعد تعليق الراسب في 1.5 mL من محلول منظم عالي الملوحة بارد، ثم قم بالتحضين لمدة 20 دقيقة على الثلج.

قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 16,000 ×g في جهاز طرد مركزي دقيق عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. بعد انتهاء عملية الدوران، قم بإزالة السائل الطافي وتخزينه عند درجة حرارة 4 °C. يمثل هذا جزء CH 500.

أخرج الأجزاء التي تم حفظها أثناء بروتوكول التجزيء وضعها على الثلج. ثم أضف 300 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 5 M إلى الجزء السيتوبلازمي. بعد ذلك، انقل 100 µL من خرزات strep T المعبأة في Sphero لكل جزء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL.

أضف 10 أحجام من محلول غسيل strep إلى الخرز. اقلب الأنبوب للمزج ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1000 ×g في جهاز طرد مركزي مكتبي، وتخلص من السائل الطافي.

كرر عملية الغسل بالمحلول المنظم مرتين، ثم أعد تعليق الراسب في حجم مساوٍ من محلول غسل strep، وأضف 200 µL من ملاط خرز strep-Act المغسول إلى كل جزء. قم بتدوير الأنابيب لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بطرد مركزي للأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 1000 ×g ودرجة حرارة 4 °C، ثم تخلص من السائل الطافي.

ثم أضف 1 mL من محلول الغسيل إلى الحبيبات التي تم تحضينها مع الكسر السيتوبلازمي في أنبوب سعة 15 mL. أضف محلول الغسيل وانقل الحبيبات إلى أنبوب سعة 1.5 mL. اغسل الحبيبات لمدة دقيقة واحدة، ثم قم بمركزة الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 1000 ×g في درجة حرارة 4 °C.

كرر العملية مرتين بعد خطوة الغسل الأخيرة. تخلص من جميع آثار محلول الغسل باستخدام طرف ماصة مسطح. ثم أضف 100 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) وامزجه برفق، ثم ضع الأنابيب على الثلج لمدة 15 دقيقة.

أثناء فترة الحضن، اخلط الحبيبات من حين لآخر عن طريق النقر بلطف على الجزء السفلي من الأنابيب. وبعد مرور 15 دقيقة، قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 1000 ×g في درجة حرارة 4 °C. اجمع المادة الطاردة التي تحتوي على VRPs ذات علامة strep المهلجنة.

تم إصابة خلايانا بسلالة فيروس الإنفلونزا WSN لمدة تسع ساعات، وجرى تحليل المستخلصات المجزأة بواسطة لطخة ويسترن كما هو موضح هنا. يعمل العزل اللطيف للنواة على استخلاص البروتينات السيتوبلازمية مثل tubulin بكفاءة مع تجنب إطلاق البروتينات النووية الوفيرة. يرجى ملاحظة أن جزء الكروماتين المستخلص بملح منخفض يكون غنياً بالبروتينات المهمة لعملية النسخ.

بينما يحتوي جزء الملح العالي بشكل أساسي على النوكليوسومات، فقد تم تحليل vRNPs من خلايا R المصابة لمدة تسع ساعات بفيروس غير مُوسوم، أو RWSN، أو RWSN PB2 strep، عن طريق التلوين بالفضة كما هو موضح لجزء نضحي سيتوبلازمي، وذلك لتحديد التركيب البروتيني للجزء السيتوبلازمي المستخلص. وهنا توجد نسبة عالية من NP إلى PA و PB1 و PB2، كما يتضح من النطاق الرئيسي فوق 55 kilodaltons مقارنة بالنطاقات الموجودة بين 95 و 100 kilodaltons، مما يشير إلى أن معظم strep PB2 يتم تنقيته كجزء من vRNP مكتمل التكوين، أو بعبارة أخرى، يتم التقاط القليل من البوليميراز الذائب لمقارنة العوائد النسبية. تم تنقية vRNPs بعد تسع ساعات من الإصابة بـ RWSN PB2 strep أو RWSN، وتم تلوينها بالفضة كما هو موضح في هلام التلوين بالفضة هذا؛ حيث يمكن تنقية vRNPs من جميع الأجزاء الخلوية الأربعة بعد تسع ساعات من الإصابة.

يوجد أعلى تركيز من البروتينات النووية الريبوزية الفيروسية (v RMPs) في البلازما النووية، على الرغم من إمكانية تنقية كميات كبيرة منها أيضاً من السيتوبلازم والكروماتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية عوائد عالية من معقدات البروتين النووي الريبوزي لفيروس الإنفلونزا السليمة من نواة الخلايا المصابة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام محاليل منظمة نظيفة وتجنب تعريض العينات لدرجة حرارة الغرفة دون ضرورة، وذلك لتجنب تحلل كل من RNA والبروتين، فضلاً عن تجنب تفكك المعقد البروتيني.

ولا تنسَ أن العمل مع فيروس إنفلونزا مُعدٍ قد يكون خطيراً. يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء عمل من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (biosafety level two) حتى يتم إضافة NP 40 إلى المستخلصات.