بروتوكول لجمع البنكرياس الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح البنكرياس البشري بطريقة تحافظ على التوجه التشريحي. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الاثني عشر والطحال من البنكرياس، ثم إزالة الدهون والأوعية الدموية الزائدة منه. وتتمثل الخطوة الثانية في تلوين السطح الأمامي بالحبر الأزرق والسطح الخلفي بالحبر الأسود.

بعد ذلك، يتم تقسيم البنكرياس إلى ثلاث مناطق. ثم تُقطع كل منطقة عرضياً إلى شرائح متساوية وتوضع في كاسيتات بارافين، أو قوالب OCT، أو تُفرم بشكل أكبر وتوضع في أنابيب. وفي النهاية، تُجمع العينات من جميع مناطق البنكرياس الثلاث، مع الحفاظ على التوجيه التشريحي الصحيح للتحليلات المستقبلية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في معالجة أسئلة جوهرية في أبحاث مرض السكري من النوع الأول، مثل الآليات الكامنة وراء فقدان كتلة خلايا بيتا، أو وظيفتها، وطبيعة هجوم الخلايا المناعية. ويُعد العرض المرئي لطريقة معالجة البنكرياس أمرًا بالغ الأهمية، حيث يتطلب الحفاظ على اتجاه البنكرياس كما هو في الجسم الحي اهتمامًا دقيقًا بالتفاصيل. ستقوم بتقديم هذا الإجراء ليندا سنايدر، اختصاصية الأنسجة، وإميلي مونتغمري، العالمة البيولوجية في مختبري.

ابدأ بتحضير جميع المواد اللازمة للإجراء. أولاً، قم بوضع ملصقات تعريفية على الكاسيتات التي ستحتوي على كتل البارافين، تتضمن معرف المتبرع، ونوع العينة، ورقم الحصة، وأي معلومات إضافية. بعد ذلك، قم بوضع ملصقات تعريفية على قوالب OCT بنفس الطريقة.

قص قطعاً كافية من ورق الألومنيوم لتغليف كل كتلة OCT وضعها جانباً لاستخدامها لاحقاً. جهز جميع الأنابيب اللازمة لتخزين العينات الطازجة والمجمدة. أضف RNA later ووسط RPMI عند الاقتضاء.

بعد ذلك، قم بتجهيز مناطق العمل، وضع ألواح التشريح، والأدوات المعقمة، وجميع المستلزمات الأخرى اللازمة للإجراء داخل غطاء السلامة البيولوجية وعلى سطح العمل. رتب جميع الكاسيتات وقوالب OCT وفقاً لترتيب استخدامها وبشكل قريب. قم بإنشاء حمام تجميد عن طريق إضافة كمية كافية من isop pentane لتغطية الثلج الجاف الموجود في قاع صندوق من البوليستيرين.

لبدء عملية التشريح، قم بإزالة الاثني عشر والطحال. ابدأ بفصل الاثني عشر والبنكرياس عند أحد الطرفين، واستمر في ذلك حتى ينفصلا تماماً. يكون الطحال مرتبطاً بشكل فضفاض، مما يسهل إزالته من الدهون والبنكرياس.

بعد ذلك، قم بتنظيف البنكرياس من الأوعية الدهنية والأعصاب الزائدة باستخدام مزيج من التشريح الكليل والحاد. اعزل الدهون والعقد الليمفاوية لمعالجتها لاحقاً. وبمجرد التنظيف، ضع البنكرياس على لوح تشريح مغطى بمناشف ورقية.

يعد الحفاظ على التوجيه الصحيح للبنكرياس الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. ولضمان النجاح، يتم طلاء السطحين الأمامي والخلفي بأحبار ذات ألوان مختلفة. اغمس أداة تطبيق ذات طرف قطني في حبر أزرق، ووزع الحبر على السطح الأمامي للبنكرياس ثم جفف الزائد منه.

بعد ذلك، اغمس أداة تطبيق جديدة في حبر أسود ووزعه على السطح الخلفي للبنكرياس. أعد البنكرياس إلى وضعيته الطبيعية. ومع توجيه السطح الأمامي للأعلى، يصبح البنكرياس الآن جاهزاً للتقسيم إلى ثلاثة مقاطع.

أولاً، يتم قطع الوصلة بين الرأس والجسم. بعد ذلك، يتم تقسيم الجزء المتبقي إلى أجزاء متساوية تقريباً لفصل الجسم والذيل، ثم يتم تسجيل وزن كل منطقة من مناطق البنكرياس، بدءاً من قسم الرأس.

قسّم كل منطقة إلى مقاطع يبلغ طول كل منها 0.5 سنتيمتر تقريبًا عن طريق القطع بشكل مستعرض، على غرار تقطيع رغيف الخبز. وبمجرد تقطيع كل منطقة من البنكرياس، قم بإزالة المقطع الأخير من منطقة الرأس، وهو المقطع الواصل بين الرأس والجسم، وضعه على لوح تشريح منفصل. ثم افرم هذا المقطع إلى قطع صغيرة ووزع القطع بالتساوي بين أنابيب تجميد (cryo vials) مُصنفة، بعضها مخصص لـ RNA وبعضها الآخر بدون RNA.

بعد ذلك، يتم تجميد القوارير وفقاً للإجراءات القياسية. كرر هذه العملية لقسم منطقة الاتصال بين الجسم والذيل.

بمجرد جمع العينات المفرومة، قم بإمالة جميع المقاطع العرضية نحو اليمين. سيتم إزالة مقاطع متبادلة من كل منطقة. بالنسبة لكتل البارافين وOCT، قم بإزالة المقطع الأول الخاص بحجب البارافين.

إذا كان المقطع كبيراً جداً، فقم بقصه إلى نصفين. قم بتسمية الكاسيتات A وB. وإذا كانت القطعة لا تزال كبيرة جداً، فقم بقص كل مقطع بشكل عمودي على القص السابق، ثم قم بتسمية الكاسيتات من A إلى D باتجاه عقارب الساعة. كما يظهر هنا، ضع الكاسيت بحيث تكون التسمية جهة اليسار.

بعد ذلك، ضع النسيج في الكاسيت وأغلق الغطاء. انقل الكاسيت إلى وعاء يحتوي على فورمالين منظم متعادل. قم بترقيم القوالب بالتسلسل داخل كل منطقة، بدءًا من المقطع الأكثر إنسية بالنسبة لقوالب OCT.

صُب طبقة رقيقة من وسط OCT في قالب مُصنّف مسبقاً. وقبل إدخال النسيج، قم بتغطية النسيج بوسط OCT وجَمّد العينة بسرعة لاستخدامها لاحقاً بالرجوع إلى النسيج الذي تم تنحيته سابقاً. اعزل العقد اللمفاوية البنكرياسية عن طريق قص الدهون والأنسجة الضامة المحيطة بكبسولة العقدة. ضع العقد في طبق معقم يحتوي على DMEF، وقم بتقطيع العقد الكبيرة إلى قطع لا يتجاوز حجمها 0.5 centimeters.

بمجرد عزل العقد اللمفاوية البنكرياسية، يتم تقسيم النسيج بين الأنابيب والكاسيتات المُجهزة لمزيد من المعالجة. وبعد الانتهاء من العقد اللمفاوية، يتم تقطيع الطحال وتخزينه بطريقة مماثلة. ولمعالجة الاثني عشر، استخدم قطعة شاش مبللة لمسح المخاط من الغشاء المخاطي، ثم قم بقص الغشاء المخاطي، وبعد ذلك قطعه إلى أقسام.

قم بتقسيم عينات المخاطية كما هو موضح سابقاً. وباستخدام هذا الإجراء، يتم جمع عينات ممثلة لكل منطقة من مناطق البنكرياس كما يظهر هنا. وكانت أوزان مناطق الرأس والجسم والذيل متساوية تقريباً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة البنكرياس البشري لتحويله إلى أنواع مختلفة من العينات، وتحديداً القدرة على الحفاظ على التوجه التشريحي، بالإضافة إلى كيفية عزل العقد اللمفاوية من الدهون المحيطة بالبنكرياس.