ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

نصف في هذا الفيديو إجراءً فعالاً من حيث الوقت والتكلفة للتعبير عن البروتينات المفرزة من خلايا HEC 2 9 3 T. في البداية، يتم تحضير مستنبت من خلايا HEC 2 9 3 T بنسبة تلاقي 40% في طبق سداسي الفجوات. ثم يتم تحضير خليط ترنسفكشن عن طريق تخفيف GeneJuice، ثم بلازميدات الاختبار في وسط خالٍ من المصل.

يتم وضع خليط transfection على الخلايا، والتي تُحضن بعد ذلك عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير البروتيني. ويمكن الكشف عن البروتين في العامل الطافي عن طريق western blot. وبمجرد تحديد التركيب المناسب، يمكن توسيع نطاق الإجراء باستخدام مصانع خلوية مكونة من 10 طبقات.

يتم ترانسفكشن الخلايا باستخدام PEI ككاشف للترانسفكشن. ويمكن حصاد البروتين من سوائل المزرعة العلوية باستخدام الترشيح بالتدفق المماسي متبوعاً بالكروماتوغرافيا الألفينية. وفي النهاية، تتيح هذه المنصة التعبير عن مجموعة واسعة من الجزيئات الضخمة بكميات تصل إلى milligram.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تعبير الخلايا الحشرية القائم على فيروس balo، في إمكانية فحص عدد كبير من البنى الجينية وتوسيع نطاق التعبير عنها مع الحصول على النتائج في غضون ثلاثة أسابيع. سيقوم بتوضيح هذا الإجراء Hello Aiden وShada Zini وJonathan Cook، وهم ثلاثة طلاب دراسات عليا من مختبري. ابدأ بزراعة 250,000 من خلايا HEC 2 9 3 T في كل بئر بحجم 1 mL في طبق يحتوي على ستة آبار، ثم أضف 1 mL في كل بئر من وسط DMEM المكمل بـ 10% FBS وpentre، وقم بهز الطبق لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ.

ثم يتم تحضين الخلايا طوال الليل في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. وبمجرد أن تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 40%، يتم استبدال السائل الطافي بـ 2 mL من الوسط الغذائي الطازج لتحضير خليط عفن الخلايا. أولاً، يتم توزيع 90 µL من وسط DMEM الخالي من المصل في أنبوب إبندورف.

أضف بعد ذلك 3 µL من gene juice، وهو كاشف عفن الخلية (transfection reagent)، ثم امزج محتويات الأنبوب بلطف وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 10 µL من مخزون بتركيز 100 ng/µL من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (plasmid DNA) المنقى بواسطة تقنية mini prep والمراد عفنه.

امزج محتويات الأنبوب واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ولإجراء عملية عفن الخلايا (transfection)، أضف المزيج إلى خلايا HEC 2 9 3 T. قم بهز الطبق بلطف، قطرة تلو الأخرى، لتوزيع مزيج العفن بالتساوي.

بعد ذلك، تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية. وبعد 24 ساعة، يُضاف 1 mL من الوسط الغذائي الطازج إلى كل بئر وتُحضن لمدة 48 ساعة إضافية. وبعد ثلاثة أيام من عملية عفن الخلايا (transfection)، يُجمع السائل الطافي ويتم الكشف عن مستويات تعبير البروتين المستهدف عن طريق لطخة ويسترن (western blot).

بمجرد تحديد التركيبة المناسبة، يمكن زيادة نطاق عملية عفن الخلايا (transfection). باستخدام مصانع خلايا مكونة من 10 طبقات، يتم ملء مصنع الخلايا بـ 1.2 لتر من DMEM المكمل بـ 5%FBS. ثم يتم إضافة 200 مليون من خلايا HEC 2 9 3 T، مع توزيع الخلايا بالتساوي على جميع الطبقات.

تحتوي أربع دوارق زراعة خلايا من نوع T 225 بمساحة 225 سنتيمتر مربع، نمت حتى وصلت إلى نسبة تلاقي 100%، على حوالي 200 مليون خلية. يتم تحضين الخلايا عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل. يتم تحضير خليط عفن الجينات (transfection mixture) في دورق T 75 عن طريق تخفيف 840 µg من DNA في 84 mL من sterile 1× PBS.

أضف 2.5 milliliters من محلول البولي إيثيلين إيمين (polyethylene ion) بتركيز one milligram per milliliter، أو PEI، وحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 minutes. يجب أن يصبح المحلول عكراً. بعد ذلك، صب خليط ترانسفكشن (transfection) ببطء في مصنع الخلايا (cell factory) ووزعه بشكل شامل.

الطبقات العامة. أضف حمض الفالبرويك بتركيز نهائي قدره 4 mM. سيؤدي ذلك إلى زيادة إنتاجية التعبير بمجرد إضافة خليط عفن الخلية (transfection mixture).

يتم تحضين المزرعة عند 37 degrees Celsius لمدة أربعة أيام للسماح بالتعبير البروتيني. يتم حصاد الوسط بعد أربعة أيام من عملية transfection، وتُنظف مصنع الخلايا فوراً لإعادة استخدامه، ثم يُطرد الوسط المجموع مركزياً عند 6,000 G لمدة 30 دقيقة عند 4 degrees Celsius، ويُرشح عبر جهاز ترشيح فراغي بمرشح steric cup بمسامية 0.22 micron لإزالة أي مواد جسيمية. بعد ذلك، يُستخدم نظام ترشيح التدفق المماسي centra mate لتركيز الرائق إلى 75 milliliters.

بمجرد تركيز السائل الطافي، يمكن تنقية البروتين المستهدف باستخدام كروماطوغرافيا الألفة. في هذه التجربة، قمنا بتنقية الوحدات الفرعية المرتبطة بـ HA للنطاق خارج الخلوي لمستقبلات AAL two البشرية باستخدام النظام واسع النطاق الموصوف هنا، متبوعاً بكروماطوغرافيا anti THA عالية الألفة. كما هو موضح في تحليل SDS page المصبوغ بصبغة kumasi.

تهاجر النطاقات خارج الخلوية للوحدات الفرعية ألفا وجاما لمستقبل الإنترلوكين 2 عند أوزان جزيئية تبلغ 40 kilodaltons و 46 kilodaltons. تسبب عدم تجانس جليكانات EnLink الموجودة على IL two R alpha و IL two R gamma في توسع النطاقات على هلام SDS page. ويمثل النطاق ذو الوزن الجزيئي الأعلى مادة BSA الملوثة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات من مزارع الخلايا البشرية باستخدام مصانع الخلايا ذات الـ 10 طبقات. لا تنسَ أن خلايا HC 2 93 T تُعتبر مواد ذات خطر بيولوجي ويجب التعامل معها في المستوى الثاني من السلامة البيولوجية. يرجى ارتداء ملابس الوقاية الشخصية المناسبة دائماً، ويجب تعقيم الأسطح وفقاً للإرشادات المؤسسية والحكومية.