وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل ميثيلة الحمض النووي DNA في بويضة واحدة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة خلايا الكمulus وsoap palita من البويضات التي تم جمعها. والخطوة الثانية هي غمر البويضة في محلول aros lysis بنسبة اثنين إلى واحد لحماية الكمية الضئيلة من الـ DNA من الفقد أو التحلل.

بعد ذلك، يتم إجراء طفرات ثنائي الكبريتيت، يليه التضخيم من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. وتتمثل الخطوة النهائية في ربط واستنساخ ناتج تفاعل PCR. ثم يتم اختيار المستنسخات وتضخيمها بواسطة تفاعل PCR وإرسالها للتسلسل.

في النهاية، يُستخدم التطفير بالبيسلفيت والتسلسل لإظهار مثيلة DNA عند سيتوزين فوسفات جوانين، أو ثنائيات النوكليوتيد CPG في منطقة معنية داخل بويضة واحدة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التطفير بالبيسلفيت لأعداد كبيرة من الخلايا، في إمكانية الحصول على البيانات من بويضة واحدة دون الحاجة إلى تجميع الخلايا، وتجنب انحياز PCR والتلوث الخلوي الكيميائي. في يوم جمع البويضات، قم بتحضير المحاليل المدرجة في البروتوكول المكتوب حديثاً، وعند تحضير المحاليل، قلل من احتمالية تلوث DNA عن طريق تغيير القفازات بشكل متكرر واستخدام رؤوس ماصات ذات مرشحات، كما حافظ على إمالة الأنابيب بعيداً عند فتحها وأغلق جميع الأنابيب عندما لا تكون قيد الاستخدام.

ابدأ عملية جمع البويضات (OSI) بوضع قنوات فالوب المستأصلة من الفأر في وسط M2، ثم اسحب البكرة M لاستخراج معقد الخلايا التاجية. بعد ذلك، افصل البويضات عن معقد الخلايا التاجية باستخدام محلول هيالورونيداز بتركيز 0.3 mg/mL في قطرة بحجم 30 µL من وسط M2. حافظ على البويضات في المحلول فقط للفترة الزمنية اللازمة لإزالة الخلايا التاجية، حيث إن التعرض الطويل قد يؤدي إلى تلفها.

اغسل البويضات في قطرات بحجم 30 µL من وسط M two عن طريق نقل البويضات من قطرة إلى أخرى، مع إزالة خلايا الكتلة المحيطة (cumulus cells) بشكل دوري لإجراء ثلاث غسلات إجمالية. قم بإزالة Z of LUCITA باستخدام محلول tpyro الحمضي.

ضع البويضات أولاً في قطرة واحدة بحجم 30 µL من المحلول، ثم انقلها إلى قطرة أخرى بحجم 30 µL؛ وذلك لأن أي وسط يتم نقله معها سيؤدي إلى تخفيف الحمض وتقليل كفاءته. أبقِ الخلايا في المحلول فقط للمدة الزمنية اللازمة لإزالة المنطقة الشفافة، حيث أن التعرض الطويل قد يؤدي إلى إتلافها.

بعد إزالة المنطقة الشفافة، اغسل الخلايا مرة أخرى في قطرة بحجم 30 µL من وسط M2؛ ولإجراء عملية التضمين في Agarose، ضع أولاً محلول التحلل على كتلة تسخين عند درجة حرارة 70 °C. أضف Agarose منخفض درجة الانصهار (LMP Agarose) المسخن مسبقاً إلى محلول التحلل، بحيث تكون النسبة 2:1 من Agarose إلى محلول التحلل. ثم ضع بويضة واحدة على شريحة زجاجية نظيفة في كمية قليلة من وسط M2.

الخطوة التالية هي غمر الخلية الواحدة في محلول Agros والتحلل. يجب القيام بذلك بسرعة لأن Agros يتصلب في درجات حرارة أقل من 65 °C. اسحب 10 µL من محلول Agros للتحلل باستخدام رأس ماصة تحت المجهر.

قم بطرد حوالي 1 µL أو أقل من محلول تحلل agros برفق على الشريحة الزجاجية، مع السماح له بالاختلاط بالوسط الغذائي الأدنى. اسحب البويضة برفق داخل طرف الماصة. ثم ضع كامل الـ 10 µL في أنبوبة einor تحتوي على 300 µL من الزيت المعدني بحيث تتخذ القطرة الناتجة شكلاً كروياً.

يُحضن الأنبوب على الثلج لمدة 10 دقائق لإجراء عملية التحلل. تُزال 300 µL من الزيت المعدني ويُضاف 500 µL من منظم تحلل SDS. تُحضن العينة طوال الليل في حمام مائي مضبوط على 50 °C في اليوم الثاني.

قم بتحضير محاليل الطفرات الكبريتيدية الثنائية طازجة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ابدأ عملية إحداث الطفرات بإزالة 500 microliters من منظم ليزيس SDS بالكامل. ضع في اعتبارك أن أي كمية متبقية من منظم الليزيس ستؤدي إلى تخفيف الـ agros عند تسخينه، مما يجعل الخرزة أكثر عرضة للذوبان في الخطوات اللاحقة.

بعد الإزالة الكاملة لمحلول التحلل، أضف 300 µL من الزيت المعدني. يتم تحضين العينة لمدة دقيقتين ونصف على كتلة تسخين بدرجة حرارة 90 °C. استخدم أداة لتحريك أو رج العينة، أو لبسطها، أو لتقليب درجة الحرارة.

بعد مرور دقيقتين ونصف، يتم تحضين العينة على الثلج لمدة 10 دقائق. ولإجراء عملية المسخ، يتم إزالة الزيت المعدني وإضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 مولار إلى الأنبوب، ثم يُنقر على الأنبوب ويُقلب من خمس إلى ست مرات.

قم بحضن العينة لمدة 15 دقيقة. في حمام مائي مضبوط على 37 °C مع التقليب كل ثلاث إلى أربع دقائق، يجب أن تطفو الخرزة في هيدروكسيد الصوديوم. لاحظ أن الخرزة لم تعد في قاع الأنبوب.

لإجراء المعالجة بالسلفيت، قم أولاً بتدوير الأنبوب برفق بعد إزالة هيدروكسيد الصوديوم. أضف 300 µL من الزيت المعدني و 500 µL من محلول BIS sulfite. احرص على تجنب التعرض للضوء واترك الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 50 °C لمدة ثلاث ساعات ونصف.

قم الآن بإجراء عملية إزالة التسمم. أولاً، حضّن العينة على الثلج لمدة ثلاث دقائق قبل إزالة الزيت المعدني ومحلول BIS sulfite. بعد عملية طرد مركزي خفيفة، أضف 1 mL من sodium hydroxide بتركيز 0.3 M، ثم قم بنقر الأنبوبة وقلبها من خمس إلى ست مرات.

قم بتحضين العينة لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C مع التقليب كل ثلاث إلى أربع دقائق؛ ومجدداً، يجب أن تطفو الحبيبات في هيدروكسيد الصوديوم قبل البدء في عملية PCR. اغسل العينات عن طريق إجراء طرد مركزي خفيف أولاً.

بعد ذلك، قم بإزالة هيدروكسيد الصوديوم وأضف 1 mL من 1x TE بـ pH 7.5. رجّ المزيج لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد عملية طرد مركزي ثانية خفيفة، قم بإزالة 1x TE.

كرر عملية الغسل هذه مرتين. ثم أضف 1 mL من الماء المقطر مرتين والمعقم بجهاز الأوتوكلاف. رج الأنبوب لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بالطرد المركزي برفق للمرة الثالثة وتخلص من الماء.

كرر عملية الغسل بالماء المقطر مرتين. وأخيراً، قم بإزالة جميع السوائل الطافية، مع ترك حبيبة aros فقط. تحقق من أن pH السائل الطافي هو 5.0.

إذا كان السائل الطافي لا يزال قاعدياً جداً، اغسل الحبيبات مرة أخرى بماء مقطر مزدوج. وفي هذه الأثناء، أضف مزيج الـ PCR للجولة الأولى إلى أنبوب الـ PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. حرك الـ solid agro speed إلى حافة أنبوب einor.

بعد ذلك، قم بنقل agro speed بعناية إلى أنبوب PCR، وسخنه عند 70 °C لمدة دقيقة واحدة مع الخلط، ثم ابدأ بالتضخيم كما هو مقترح في البروتوكول المكتوب. وعقب جولة التضخيم الأولى، قم بتحضير تفاعل PCR للجولة الثانية باستخدام 5 µL من ناتج الجولة الأولى كقالب. تأكد من وضع الماصة أسفل طبقة الزيت المعدني.

باشر بإجراء الجولة الثانية من التضخيم كما هو موضح في النص كاختبار تشخيصي. يمكن قطع عينات الجولة الثانية باستخدام إنزيم قطع متخصص في الميثيلية أو السلالة، ثم يتم إجراء الرحلان الكهربائي لنواتج الهضم على هلام أكريلاميد بتركيز 8%acrylamide. تمثل أي نطاقات غير متجانسة ناتجة وجود أكثر من تسلسل واحد؛ ولاستنساخ ناتج الجولة الثانية، يتم ربطه في الناقل وإجراء استنساخ TA كما هو موضح في المخطوطة المرافقة لهذا الفيديو. بعد استنساخ TA، يتم صب جميع خليط التفاعل على طبق agar وLB، مُدعم بـ ampicillin وex gal وIPTG، ويُحضن الطبق عند درجة حرارة 37 °C طوال الليل.

ثم أضف المزيج الرئيسي لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للمستعمرات إلى أنبوب PCR كما هو مدرج في البروتوكول المكتوب. التقط مستعمرة بكتيرية بيضاء من الطبق باستخدام طرف ماصة وقم بتحريكها داخل 35 µL من المزيج الرئيسي لتفاعل PCR للمستعمرات في أنبوب PCR. تابع تضخيم المعلق كما هو موضح في النص التالي لتضخيم PCR، ثم قم بإجراء الفصل الكهربائي لـ 4 µL من ناتج PCR على هلام AGROS بتركيز 1.5%.

وأخيراً، يتم إرسال حوالي 30 µL من ناتج الـ PCR لتسلسل خمسة تفاعلات PCR للمستعمرات لكل خلية. وبمجرد الحصول على نتائج التسلسل، يمكن قراءة أنماط الميثيلة؛ حيث إن أي سيتوزين جوانين أصلي ظل كما هو كان ميثيلياً. وعلى العكس من ذلك، فإن أي سيتوزين جوانين أصلي تحول الآن إلى ثايمين جوانين كان غير ميثيلي بعد تضخيم الـ PCR المتداخل باستخدام بادئات محولة بالبيسلفيت.

من الممكن تأكيد نجاح عملية التحويل من خلال معاينة الحجم الصحيح للقطعة على هلام الأجاروز في كل طور استوائي فردي. تمثل كل بويضة أليلاً أبوياً واحداً، وبناءً على ذلك، فإنها تمتلك نظرياً نمط مثيلة بصمة واحدة. ويمكن اختبار نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الجولة الثانية للتحقق من عدم وجود تلوث غير مقصود.

يمكن استخدام إنزيم قطع حساس لمثيلة DNA لهضم ناتج جولة PCR الثانية لتقييم ما إذا كان يحتوي على أليل مُمَثيَل أو غير مُمَثيَل. هنا، يتم قطع السيتوزين المُمَثيَل الموجود ضمن تسلسل التعرف الخاص بالإنزيم. بينما لا يتم التعرف على السيتوزين غير المُمَثيَل الذي تحول إلى ثايمين بواسطة الإنزيم ويظل غير مقطوع؛ لذا يجب التخلص من أي عينة بويضة في الطور الاستقلابي الثاني تحتوي على كل من الأليلات المُمَثيَلة وغير المُمَثيَلة، لأن ذلك يشير إلى تلوث بخلايا محيطة أو وجود الجسم القطبي بعد عملية الربط والتحول.

يمكن تصور نجاح تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمستعمرات على هلام AROS للتأكد من إرسال العينات التي تحتوي على الحجم الصحيح للمنتج إلى التسلسل. في هذا المثال، يبلغ حجم القطعة المضخمة المتوقع بعد الربط 56 base pairs. وهنا، يظهر أن المستنسخ الخامس لديه حجم قطعة مضخمة غير صحيح، وبالتالي لا ينبغي إرساله للتسلسل.

يجب أن ينتج عن تسلسل خمس مستنسخات فردية من بويضة في الطور الاستوائي الثاني خمسة أنماط مثيلة متطابقة ومعدلات تحويل غير CPG متطابقة. ويجب التخلص من أي عينات تحتوي على أكثر من نمط واحد. وبما أن البويضات المتبايضة في الطور الاستوائي الثاني تحتوي على نسختين من الكروموسومات أو جسم قطبي متصل، فهناك احتمالية للحصول على نمطي تسلسل متشابهين.

يجب استبعاد البيانات من أي خلايا تظهر أنماط ميثيلية متباينة للغاية. وبما أنه لا يمكن استبعاد تلوث الخلايا الركامية عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، فمن المهم تذكر غسل البويضات عدة مرات في وسط طازج أولاً، بعد المعالجة بـ HI IDE لإزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا الركامية. ثانياً، سيتصلب agarose ذو درجة الانصهار المنخفضة عند درجات حرارة أقل من 65 °C، لذا يجب العمل بدقة ولكن بسرعة.

وفي الختام، فإن بيسلفات الصوديوم والهيدروكينون حساسان للضوء، لذا يجب تغليف أنابيب التفاعل والمحاليل بورق القصدير.