بصري تسجيل النشاط العصبي للقرار suprathreshold وحيدة الخلية واحد مسمار-

يتمثل الهدف العام من تجربة FollowMe في تسجيل نشاط الارتفاع العصبي (neural spiking activity) من عدد كبير من العصبونات. ويتحقق ذلك في الخطوة الأولى من خلال مراقبة الزيادة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في جسم العصبون المرتبط بكل جهد فعل باستخدام المجهر الفلوري. ويُستخدم استثارة الفوتونين ومبدأ المسح العشوائي لتسجيل إشارات فلورية للكالسيوم من 40 جسم عصبوني بدقة مكانية وزمنية عالية.

في الخطوة الثانية، يتم استخراج توقيتات النبضات الدقيقة من الإشارات الفلورية باستخدام خوارزمية فك الالتفاف. ويمكن استخدام هذه التقنية لتسجيل نشاط النبضات من عشرات العصبونات. ومن ثم يمكن استخدام بيانات النبضات لقياس المعلومات المتبادلة، أو انتشار الإشارات بين المجموعات العصبونية، أو الارتباطات العصبية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تسجيلات الأقطاب الكهربائية الدقيقة، في إمكانية تسجيل نشاط الومضات العصبية لعدد كبير من العصبونات من مجتمع محلي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة عن أسئلة جوهرية حول الوظيفة القشرية على مستوى الشبكات المحلية من العصبونات، مثل أهمية البحث عن الارتباطات في المعلومات والتغيرات في ديناميكيات الشبكات مع اللدونة القشرية. ولتحقيق الإثارة ثنائية الفوتون، يُستخدم نظام ليزر نبضي بالأشعة تحت الحمراء بنبضات فيمتوثانية. وتتطلب العملية قدرة خرج ليزر عالية لتعويض الفقد الكبير الناتج عن المكونات البصرية للنظام.

يقوم نظام تشتيت يتكون من منشورين بإضفاء تشتت سرعة مجموعة سلبي على نبضات الليزر قبل وصولها إلى العاكسات الضوئية المخصصة لتعويض التشتت الزمني الذي تسببه أجهزة AODs؛ حيث يقوم جهازا AODs بفتحات كبيرة بتحويل مسار شعاع الليزر في بُعدين. ويوضع محزز حيود عاكس يحتوي على 100 خط لكل مليمتر على مسافة 13 سنتيمتراً خلف أجهزة AODs لتعويض التشتت المكاني الناتج عنها. وعند استخدام نبضات ليزر قصيرة، يتم توجيه شعاع الليزر عبر تليسكوبين ترحيليين إلى منفذ الكاميرا في مجهر رأسي.

يتم وضع الحجابات بفاصل زمنية منتظمة لمحاذاة المكونات البصرية. ويقوم مقسم شعاع ثنائي اللون موجود أمام الشيئية بنقل ضوء الإثارة بالأشعة تحت الحمراء إلى العينة وعكس ضوء الفلورة من العينة باتجاه الكاشف. وتقوم كواشف الفلورة العلوية (Epi) والنافذة (trans) بجمع إشارة الفلورة عبر الشيئية، كما تُوضع مرشحات زجاجية ملونة للمكثف أمام الكواشف لمنع وصول ضوء الإثارة إليها.

يتم التحكم في زوايا انحراف A OD بواسطة جهاز كمبيوتر مجهز بلوحة محول رقمي تماثلي، والتي تقوم بدورها بتشغيل مذبذبات محكومة بالجهد. يتم نقل الإشارة من مضاعفات الضوء عبر مرشح "باتروورث" منخفض التمرير بتردد قطع قدره 100 kilohertz، ثم يتم تحويلها إلى صيغة رقمية بواسطة محول تماثلي رقمي بمعدل ساعة يبلغ 156.25 kilohertz قبل تخزينها على جهاز الكمبيوتر للتحليل. يتم اختبار المحاذاة والضوضاء الكهربائية من خلال تسجيل توزيع الإشارات الفلورية مع وبدون ضوء الليزر عند كسب منخفض وعالٍ لمضاعفات الضوء، وكذلك مع وبدون المؤشر. يعتمد المسح العشوائي المرتعش للوصول المباشر على اكتشاف الزيادات في الكالسيوم داخل الخلايا. تتمثل الخطوة الأولى في البروتوكول في صبغ عدد كبير من العصبونات باستخدام صيغة الإستر لمؤشر الكالسيوم عن طريق الحقن الكتلي.

بعد ذلك، قم بتسجيل نشاط جسم الخلية في كل عصبون عند أربعة مواقع لمدة 6.4 microseconds في كل موقع. ولاختيار العصبونات المراد دراستها، قم بالتقاط إطار كامل يتكون من 256 في 256 بكسل، ثم حدد يدويًا مراكز العصبونات التي سيتم تسجيلها ضمن هذه الصورة.

يقوم برنامج التحكم تلقائيًا بإضافة ثلاث نقاط بمسافة 2 µm حول كل مركز في كل دورة. ويتم تسجيل الإشارة الفلورية من المواقع الأربعة في جميع الخلايا العصبية الـ 40. ويتطلب التسجيل من جميع الخلايا العصبية في دورة واحدة زمنًا قدره 1.536 مللي ثانية.

كرر هذا التسجيل المتسلسل لجميع العصبونات الـ 40 لمدة خمس ثوانٍ. يعتمد الكشف عن الموجات الشوكية (Spikes) من إشارات الكالسيوم الجسدية الفلورية على نسبة إشارة إلى ضجيج عالية. ويمكن تحقيق نسبة إشارة إلى ضجيج عالية عن طريق زيادة شدة الاستثارة.

ومع ذلك، يمكن زيادة كثافة الاستثارة إلى حد معين فقط بسبب الضرر الضوئي. فهناك نافذة ضيقة جداً من كثافة الاستثارة يكون فيها الضرر الضوئي منخفضاً ونسبة الإشارة إلى الضوضاء كافية للكشف عن النبضات المنفردة، وذلك لضمان وقوع الإشارات المسجلة ضمن نافذة الكشف العالي عن النبضات. وخلال التجربة، يتم استخدام عدد من برمجيات التحليل المباشر التي طورها مختبرنا.

بعد ذلك، احسب معدل الفوتونات التقريبي لكل عصبون من نافذة زمنية قصيرة من ضجيج خط الأساس تتراوح بين 100 إلى 200 مللي ثانية تقريباً. يتم حساب عدد الفوتونات ومعدل الفوتونات من قيم الفلورة عن طريق مطابقة توزيع تغيرات الفلورة النسبية باستخدام هذه المعادلة، ثم احسب فلورة خط الأساس من النافذة الزمنية نفسها ومثلها بيانياً كدالة في الزمن أو المحاولات. حافظ على متوسط انخفاض خط الأساس دون 0.0002 لكل ثانية من خلال ضبط قدرة الليزر.

وذلك لأن الكشف عن النبضات (spikes) يتناقص بسرعة عند تجاوز هذا الحد. بعد ذلك، يتم التحقق من مواقع أجسام الخلايا العصبية كل 10 إلى 20 دقيقة عن طريق التقاط صورة للإطار الكامل. يتم تعديل مواقع التسجيل إذا لزم الأمر.

غالباً ما تتأخر الإشارات الفلورية الناتجة عن النشاط العصبي زمنياً بسبب الاضمحلال الطويل للعابرات الكالسيومية. في هذا الإجراء، تُستخدم طريقة فك الالتفاف لاستخلاص الومضات وتوقيتاتها من الإشارات الفلورية. نستخدم هنا خوارزمية جينية لتحديد نموذج سلسلة الومضات الأكثر احتمالاً والذي يتوافق مع الإشارة الفلورية المسجلة.

مع كل تكرار للخوارزمية، يقترب الاحتمال الأقصى تقاربيًا من قيمته القصوى التي تحددها ضوضاء تسجيلات الفلورة. وفي المجموعات غير المتجانسة من الخلايا العصبية، يمكن أن تختلف إشارة الكالسيوم المستثارة بالنبضات بين خلية وأخرى. ولإجراء تحليل غير خاضع للإشراف لمجموعات البيانات الكبيرة، صممنا خوارزمية تأخذ في الاعتبار تباين إشارة الكالسيوم المستثارة بالنبضات من خلية عصبية إلى أخرى لتجنب حدوث عدد كبير من عمليات الكشف الإيجابية الكاذبة.

يتم تسجيل التوزيع المشترك لسعة وثابت زمن الاضمحلال للعابرات الكالسيومية المستحثة بنبضة واحدة في مجموعة منفصلة من التجارب من نفس النوع من الخلايا العصبية وتحت نفس الظروف التجريبية. ولتعويض التغيرات البطيئة في الخط الأساسي وتقليل التكاليف الحسابية لعملية فك الالتفاف (deconvolution)، يتم تقسيم التسجيلات الطويلة إلى عدة آثار أقصر تتراوح مدتها من ثانية واحدة إلى خمس ثوانٍ لكل خلية عصبية في كل تسجيل. وقد يختبر خوارزم فك الالتفاف عدداً كبيراً من النماذج يصل إلى مليون نموذج مختلف أو أكثر؛ ولتسريع عملية فك الالتفاف، يتم إجراء العملية لتجربة واحدة على ما يصل إلى 10 أجهزة كمبيوتر مختلفة بالتوازي.

بعد عملية فك الالتفاف، يتم تحليل بيانات النبضات وفحصها. ويتم حساب احتمال النبضات في مدرج التكرار الزمني المحيط بالمحفز ومعدل إطلاق العصبونات بطريقة آلية. وفيما يلي أمثلة لإشارة فلورية تم تسجيلها عند معدل استثارة منخفض جداً، وأخرى عند معدل استثارة مرتفع جداً ضمن نافذة الكشف.

لاحظ أن كل مثال يوضح الاستجابة لنبضة واحدة. يظهر هنا صورة مجهرية لشريحة دماغية حادة وأنبوبي تحفيز موضوعين في نفس العمود القشري. وفي الطبقة الرابعة، تظهر هذه الاستجابات العصبية للمحفزات المتكررة، ويوضح هذا الرسم البياني معلومات شانون المتبادلة التي تشير إليها مجموعة العصبونات المسجلة.

فيما يلي قياس لانتشار نشاط الارتفاعات العصبية فوق العتبة بين مجموعات مختلفة من العصبونات القشرية. هذه هي الارتفاعات العصبية التي تم رصدها في استجابة العصبونات القشرية للتحفيز الكهربائي للألياف المهادية القشرية. عند تسجيل النشاط العصبي باستخدام المسح العشوائي، من المهم جداً التسجيل ضمن نافذة الكشف.

وإلا، فمن السهل جداً أن ينتهي الأمر بمجموعات بيانات غير قابلة للاستخدام. لا يزال الكشف الضوئي عن النبضات في مراحله الأولى، وهناك مجال واسع للتحسين.

من خلال بعض التحسينات، سنتمكن من التسجيل من عدد أكبر من العصبونات. ومع تحسينات أخرى، سنصبح قادرين على التسجيل في الحيوانات المستيقظة والتي تظهر سلوكاً نشطاً.