واحدة من خلية قياس إفراز الدوبامين في وقت واحد مع المشبك الجهد وAmperometry

الهدف من هذا الإجراء هو قياس النقل العكسي للدوبامين في عصبون يتم تثبيت جهده باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) والقياس الحراري (pyrometry) في آن واحد لقياس تحرر الدوبامين بوساطة ناقل الدوبامين (DAT). يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال اختبار سلامة القطب الحراري باستخدام الدوبامين. وتتمثل الخطوة الثانية في وضع القطب الحراري بالقرب من الخلية وتحقيق رقعة للخلية الكاملة (whole cell patch) للعصبون باستخدام ماصة الرقعة.

بعد ذلك، يتم التحكم في جهد الخلية باستخدام ماصة الرقعة (patch pipette)، وبالتزامن مع ذلك، يتم تسجيل إطلاق الدوبامين بوساطة ناقل الدوبامين (DAT) باستخدام قطب قياس حراري. تتمثل الخطوة النهائية في إضافة حاجب ناقل الدوبامين (DAT blocker) وتسجيل تيارات الخلية الكاملة والقياس الحراري مرة أخرى، وذلك للسماح بطرح التيار الذي يتم بوساطة ناقل الدوبامين تحديداً. تكمن أهمية هذه التقنية في القدرة على قياس النقل العكسي للدوبامين عبر ناقل الدوبامين مع التحكم في جهد العصبون الدوباميني في آن واحد.

يتطلب نظام تسجيل تثبيت الرقعة وقياس الضغط المتزامن مجهراً مقلوباً مزوداً ببصريات DIC ممتازة وعدسة ذات مسافة عمل طويلة لتوليد مصدر ضوء DC للنظام. ولضمان انخفاض الضوضاء الكهربائية، يتم توصيل المصباح الخاص بالمجهر ببطارية سيارة. وتُستخدم الميكرومناورات الهيدروليكية لأنها لا تساهم بشكل ملحوظ في مستويات الضوضاء في هذا التكوين.

يُستخدم مناور يد يمنى لعملية تثبيت الجهد وتسجيل الخلية الكاملة، ومناور يد يسرى لقياس الحرارة. ولتحضير القطب للتسجيل الكامل، يتم سحب ماصة كوارتز باستخدام سحابة P 2000. وعادةً ما نستخدم ماصة بمقاومة تتراوح بين ثلاثة إلى أربعة ميجا أوم.

بعد ذلك، املأ القطب الكهربائي باستخدام الماصة بالمحلول الذي يحتوي على 1 millimolar من الدوبامين. ثم ثبته على حامل الماصة الموجود في manipulator الأيمن. تأكد من تغليف الحاوية التي تضم الماصة المملوءة بمحلول الدوبامين بورق ألومنيوم وحفظها على الثلج في حال عدم استخدامها.

بما أن الدوبامين قابل للأكسدة، فإن الاحتفاظ بالمحلول على الثلج وحمايته من الضوء سيقلل من معدل الأكسدة. قم بتمرير السلك الفضي في حامل القطب الكهربائي، ثم قم بتركيب المحول البارامتري على حامل القطب الكهربائي. بعد ذلك، املأ القطب الثلاثي بكمية كافية من الزئبق حتى يلامس السلك الفضي.

عند تركيب القطب الكهربائي في المهايئ، تأكد من فحص قطب الكربون الليفي منخفض الضوضاء pro CFE والقطب البارامتري تحت المجهر للتأكد من أن الطرف نظيف وسليم. احرص على الإمساك بالطرف البعيد من ألياف الكربون لحماية طرف ألياف الكربون من التلف. بعد ذلك، قم بتركيب قطب pro CFE Tric.

قم بعد ذلك بتثبيت القطب المجمع على المناول الهيدروليكي الأيسر لفحص سلامة قطب tric. أنزله في طبق بيتري ذو قاعدة زجاجية يحتوي على المحلول الخارجي. سجل تيار خط الأساس في غياب الدوبامين.

ثم أضف 10 µL من محلول الدوبامين بتركيز 1 mM إلى الطبق. يجب أن يسجل قطب amperometric جيد زيادة في تيار الأكسدة. تأكد من فحص سلامة القطب amperometric قبل التجارب وبعدها.

في هذا الإجراء، استخرج الخلايا أو العصبونات الدوبامينية، أو الخلايا المعدلة وراثياً للتعبير عن ناقل الدوبامين والموضوعة في طبق بتري ذو قاعدة زجاجية، من الحاضنة. اغسل الخلايا أو العصبونات الدوبامينية برفق ثلاث مرات باستخدام محلول خارجي دافئ. ولتصوير الخلايا وإجراء التجربة، قم بتثبيت طبق بتري ذو القاعدة الزجاجية على منصة المجهر وابحث عن نقطة التركيز الصحيحة لرؤية الخلايا بوضوح.

بعد ذلك، قم بتطبيق ضغط موجب على قطب الرقعة (patch electrode). وباستخدام حقنة سعة 1 mL، أنزل كلا القطبين برفق في المحلول وقربهما من الخلية باستخدام أجهزة التحكم الدقيقة (micro manipulators). ثم ضع القطب المتركي (emper metric electrode) على الجانب الأيسر من الخلية وقطب الرقعة على الجانب الأيمن.

عندما يلامس قطب التصحيح (patch electrode) الخلية، قم بتطبيق شفط خفيف عن طريق الفم أو باستخدام حقنة لتكوين ختم جيجا (giga seal) على الخلية. بعد ذلك، قم بتمزيق الختم عن طريق الشفط للوصول إلى تهيئة الخلية الكاملة (whole cell configuration)، واترك الخلية لمدة تتراوح من خمس إلى ثماني دقائق للسماح بديلزة المحلول الداخلي المحتوي على الدوبامين إلى داخل الخلية.

بعد ذلك، قم بتسجيل التيارات التي يتوسطها ناقل الدوبامين (DAT) عن طريق تغيير جهد غشاء الخلية بين 60- و 100+ ملي فولت من جهد تثبيت قدره 40- ملي فولت عبر الماصة. ولتحديد تدفق الدوبامين النوعي الذي يتوسطه DAT، سجل التيارات المترية في حالة غياب وحضور مضاد لـ DAT. يتم بعد ذلك تحديد التيار النوعي الذي يتوسطه DAT من خلال طرح المخططات المسجلة في وجود مضاد DAT من المخططات المترية المسجلة بدون المضاد.

يتوافق الانحراف الصعودي في تيارات tric مع التدفق الخارجي للدوبامين الموضح هنا. تيارات متوسطة بواسطة DAT تم تسجيلها عن طريق تغيير جهد الغشاء بمقدار 20 millivolts بين ناقص 60 و زائد 100 millivolts من جهد تثبيت قدره ناقص 4 C millivolts مع احتواء الماصة على 2 millimolar من الدوبامين في وضع تثبيت الخلية الكاملة (whole cell patching mode). إليكم التيار الأمبيري الذي تم الحصول عليه بالتزامن مع تيار الخلية الكاملة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية قياس النقل العكسي للدوبامين عبر ناقل الدوبامين في عصبون مثبت الجهد. تذكر التحقق من سلامة القطب البارامتري قبل التجارب وبعدها، ولا تنسَ طرح الآثار المسجلة بوجود ذلك المناهض من الآثار المسجلة بدون المناهض.