تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف جزر البنكرياس البشرية باستخدام صبغتي الهيماتين والإيوزين والكيمياء النسيجية المناعية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد مقاطع متسلسلة من عينة بنكرياس مدمجة في قالب من البارافين، ثم يتم وضع هذه المقاطع على شرائح مجهرية مع الحفاظ على اتجاهها الأصلي.

يتم صبغ جزء من الشرائح بالهيماتوكسيلين والإيوسين بينما تُصبغ الشرائح المتبقية باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية، وتتمثل الخطوة النهائية في مسح الشرائح المصبوغة ضوئياً وتنظيمها حسب الحالة. وفي النهاية، يمكن رفع هذه الصور إلى قاعدة بيانات مرضية عبر الإنترنت حيث يمكن للباحثين الآخرين في هذا المجال الاطلاع عليها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في صبغ الشرائح على شكل سلسلة مع الحفاظ على اتجاهها الأصلي.

ستقوم بإجراء هذه العملية كل من ليندا سنايدر، أخصائية الأنسجة، وإيميلي مونتغمري، الباحثة البيولوجية، وتيفاني هيبو، فنية المختبر في مختبري. للبدء، قم بتجهيز الحمام المائي والمقطاع (microtome) باتباع الإجراءات القياسية للتقطيع المجهري للبرافين. بعد ذلك، ضع ملصقات على الشرائح ذات الشحنة الموجبة تتضمن رقم الحالة، ومنطقة البنكرياس، ورقم الشريحة.

بمجرد تجهيز كل شيء، ضع قالب البارافين في ملقط الميكروتوم بحيث يكون ملصق الكاسيت على الجانب الأيسر. واتباعاً لإجراءات القطع المجهري المعتادة، قم بقطع القالب حتى ينكشف النسيج بشكل متجانس. وبمجرد الوصول إلى النسيج بالتساوي، استخرج شريطاً من المقاطع المتسلسلة بسمك حوالي أربعة ميكرون.

يلزم تحضير من ثلاثة إلى ستة مقاطع، وذلك اعتماداً على عدد الصبغات الأولية المطلوبة. بعد ذلك، قم بفصل مقاطع الشريط. ارفع كل مقطع بالترتيب وضعه على شريحة.

سجّل رقم المقطع باستخدام قلم رصاص. إذا كان المقطع غير صالح للاستخدام، تخطَّ ذلك الرقم واستمر في ترقيم المقاطع بالترتيب الدقيق. احرص على الحفاظ على نفس اتجاه الشريحة كما كانت في الكاسيت، مع توجيه ملصق الشريحة نحو اليسار.

بعد ذلك، ضع الشرائح في حامل شرائح واتركها لتجف طوال الليل. وفي درجة حرارة الغرفة، أعد ختم سطح قالب البارافين بطبقة رقيقة من البارافين للحفاظ على النسيج، ثم قم بأرشفته في درجة حرارة الغرفة أو عند -20 °C. كرر هذا الإجراء للعينة التالية.

من المهم الحفاظ على ترقيم المقاطع المتسلسلة عند كل مستوى كما هو موضح أعلاه بالنسبة لصبغة h و e. ضع الشريحة الأولى من كل كتلة في حامل شرائح، ثم ضع الحامل في الحوض الأول من جهاز الصبغ التلقائي. اختر برنامج HE القياسي وابدأ عملية الصبغ.

عند الانتهاء من عملية الصبغ، قم بإزالة الشرائح من جهاز الصبغ الآلي ووضعها في خزانة التدفق الصفحي (the hood) من أجل وضع الغطاءات الزجاجية. ضع غطاءً زجاجياً على كل شريحة باستخدام التقنيات القياسية. وأخيراً، قم بتمييز الشرائح بملصق مطبوع واتركها لتجف تماماً داخل خزانة التدفق الصفحي.

ابدأ بإعداد جهاز التلوين التلقائي وتحضير جميع الكواشف اللازمة. اختر برنامج Daco للتلوين المزدوج. أدخل عدد الشرائح والمعالجة التي ستتلقاها كل شريحة.

قم بتحميل جميع الكواشف في جهاز التلوين التلقائي وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بتحضير محاليل TBST والسترات، والمحاليل المنظمة، والأجسام المضادة، والكواشف الأخرى المطلوبة للإجراء. قم بإزالة البارافين من الشرائح بوضعها في الزيلين لمدة خمس دقائق.

لا تسمح للشرائح بالجفاف لأن ذلك سيؤدي إلى زيادة تلوين الخلفية والمسام أثناء عملية إزالة الشمع. صب محلول منظم السيترات في جهاز البخار للتسخين المسبق قبل الاستخدام. بعد ذلك، قم بإخضاع الشرائح منزوعة الشمع لسلسلة من عمليات الغسل باستخدام الإيثانول.

اشطف الشرائح للمرة الأخيرة بالماء منزوع الأيونات. أضف الشرائح إلى محلول منظم السيترات المسخن مسبقاً واتركها تتبخر لمدة 30 دقيقة. بعد هذه الفترة، انقل الشرائح فوراً إلى حمام مائي في درجة حرارة الغرفة حتى تبرد تماماً.

بمجرد أن تبرد، انقل الشرائح إلى رفوف صبّاغة Dayco الآلية، مع الحرص على الحفاظ على التسلسل الصحيح. وأخيرًا، قم بتشغيل برنامج الصبغ المزدوج الذي تم تحميله مسبقًا. وعند اكتمال برنامج الصبغ المزدوج، أخرج الشرائح من الصبّاغة الآلية واتركها تجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء بعملية نزع الماء.

لمواصلة عملية نزع الماء، انقل الشرائح إلى إيثانول 80% لمدة دقيقة واحدة. استمر في نزع الماء من الشرائح عن طريق غمرها في إيثانول 95% ثم إيثانول 100% في النهاية. وأخيرًا، اغمس الشرائح وثبّتها في الزايلين لمدة دقيقة واحدة.

قم بتثبيت الشرائح فوراً باستخدام أغطية الشرائح مع استخدام cyto seal لإتمام الإجراء. اطبع ملصقات تحتوي على معلومات الحالة، بما في ذلك العضو ورقم الكتلة، ونوع الصبغة والتاريخ. ضع ملصقاً على كل شريحة لمسح الشرائح المصبوغة ضوئياً.

ضعها على صينية الماسح الضوئي واتبع الإجراءات القياسية. احفظ الشرائح المصبوغة في درجة حرارة الغرفة، وأي شرائح متبقية غير مصبوغة عند درجة حرارة -20 °C لاستخدامها مستقبلاً. وأخيراً، قم بتنظيم الصور المصبوغة حسب المتبرع ونوع النسيج المرصود.

فيما يلي مثال لصبغة KI 67 بالإضافة إلى الإنسولين عند مستويين من التكبير، منخفض وعالٍ. يتم إرسال صور المقاطع البنكرياسية المصبوغة إلى قاعدة بيانات باثولوجية عبر الإنترنت لإنشاء بنك حيوي افتراضي. وباستخدام قاعدة البيانات هذه، يمكن للباحثين الوصول بسرعة إلى المعلومات اللازمة للأبحاث المتعلقة بمرض السكري من النوع الأول.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك دراية جيدة بكيفية تحضير وصبغ شرائح عالية الجودة من البنكرياس البشري.