ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

غالباً ما كانت التطبيقات التي تستخدم خلايا مغلفة في قطرات صغيرة بحجم البيكوليتر محدودة بسبب عدم القدرة على التحكم في عدد الخلايا في كل قطرة. يوضح هذا البروتوكول طريقة للتحكم في تغليف الخلايا من خلال دمج ظاهرتين ميكروفلويديك متمايزتين، وهما ترتيب الخلايا بديناميكا السوائل وتوليد القطرات عند فوهة ميكروية ذات تركيز للتدفق. في قناة علوية، يتم توفير معدل تدفق عالٍ بما يكفي لمحلول مائي يحتوي على خلايا أو جسيمات معلقة للتسبب في تكوين سلاسل ذات تباعد متساوٍ في اتجاه التدفق نحو المصب.

تُستخدم فوهة توليد قطرات بتركيز تدفقي لتشكيل قطرات مائية بمعدلات تصل إلى الكيلو هرتز في سائل حامل زيتي مسموح به ومستقر بواسطة مواد خافضة للتوتر السطحي. ثم يتم دمج سلاسل الجسيمات الخلوية المنظمة مع توليد القطرات من خلال ضبط معدلات تدفق السوائل المائية والزيتية لتوفير معدلات توليد قطرات متزامنة مع وصول الخلايا أو الجسيمات المنظمة طولياً إلى فوهة توليد القطرات، بينما تُستخدم الجسيمات كبدائل للخلايا. ولإثبات هذا البروتوكول، يجب أن تكون معدلات التدفق صغيرة بما يكفي للحد من السائل.

إجهادات القص على الخلايا البيولوجية، وتداخل عملية توليد القطيرات مع ترتيب الخلايا وقدرتها على البقاء. توفر قيود معدل التدفق المائي نظاماً تشغيلياً مثالياً للتغليف المتحكم فيه للخلايا المفردة والمتعددة. ويظهر تحليل بيانات المجهر الفيديوي أن كفاءة تغليف الخلايا أو الجسيمات المفردة والمزدوجة تفوق كفاءات التغليف العشوائي، وتقلل بشكل كبير من عدد القطيرات التي لا تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا أو الجسيمات.

يؤدي حصر الخلايا والقطيرات إلى الحد من تخفيف إفرازات الخلايا، وإبراز التباين الخلوي، والتحكم أيضاً في الإشارات البينية بين الخلايا مقارنة بالتعليق الكتلي. وتوفر الوسائل الفعالة لتغليف هذه الخلايا داخل قطيرات أداة قيمة للباحثين البيولوجيين. لبدء هذا الإجراء، صمم نمط القنوات الدقيقة كما هو موضح في هذا الشكل باستخدام برنامج AutoCAD.

يمثل قسم القناة الطويلة قناة ترتيب التدفق المائي بعرض 27 ميكرون. ويوضح المخطط التفصيلي للفوهة وجود عرض متساوٍ للقنوات يبلغ 27 ميكرون لكل من قناة الترتيب المائي وقناة الزيت، تليها منطقة انقباض الفوهة بعرض 22 ميكرون، ثم تمدد مفاجئ إلى قناة أوسع بعرض 61 ميكرون. ويبلغ ارتفاع الجهاز 52 ميكرون.

تحتوي كل من مداخل المحاليل المائية والزيتية على مرشحات للشوائب الكبيرة بفجوات تقارب عرض قناة الترتيب، كما هو موضح في هذا المخطط المكبر لمدخل الزيت. تظهر هنا صورة حقيقية لقناة الترتيب والفوهة بعد حقنهما بصبغة. استعن بمصنع خارجي لطباعة قناع شفاف عالي الدقة على فيلم Mylar أو الكوارتز، بحيث تكون القنوات شفافة على خلفية داكنة.

بعد ذلك، يتم إنشاء قالب رئيسي من السيليكون ومقاوم الضوء SU-8 لعملية القولبة التكرارية. يتم تثبيت القالب الرئيسي بشريط لاصق في قاع طبق بتري للقيام بالقولبة التكرارية باستخدام PDMS. بعد اكتمال القولبة التكرارية وقص المخطط الخارجي للجهاز، يُستخدم خرام خزعة بقطر خارجي 0.75 millimeter لثقب المنافذ المائعية في المناطق المستديرة الثلاث الموضحة في هذا الشكل، ثم يُوضع شريط لاصق شفاف على الجانب المنقوش من PDMS ويُنزع لإزالة أي غبار بعد الربط بالبلازما.

تثبيت الـ PDMS على شريحة مجهرية زجاجية نظيفة. ضع الجهاز بالكامل في فرن وقم بتسخينه تدريجياً حتى 120 درجة مئوية. اترك الجهاز في الفرن عند درجة حرارة 120 درجة مئوية طوال الليل لإتمام عملية الربط ولإعادة الـ PDMS إلى حالته الأصلية الكارهة للمياه.

تتمثل إحدى الطرق البديلة لجعل السطح الزجاجي للقناة كارهاً للماء في حقن مادة طلاء مثل aquae في المنافذ السائلة ثم التطهير بالهواء. باستخدام محقنة سعة 1 ml وإبرة محقنة، اسحب عدة مئات من µL من الهواء، تليها كمية ضئيلة من aquil تكفي فقط لملء طرف المحقنة المعدني. احقن الـ aqua بعناية وبقوة، يليه الهواء المطهِّر، في المنافذ السائلة، مع تجنب الضغط الشديد الذي قد يؤدي إلى كسر الرابطة بين PDMS والزجاج.

كرر عملية التطهير بالهواء على جميع منافذ الإدخال والإخراج مع مسح أي مياه زائدة لتجنب تكون أي ترسبات قد تسد القنوات عند الجفاف. يعد التحكم في تركيز الخلايا أمرًا أساسيًا لتحقيق العدد المناسب من الخلايا في العدد المناسب من القطرات، ويتكون ذلك من عنصرين يمثلان تحديًا.

تتمثل الخطوة الأولى في تقدير التركيز المناسب مسبقاً، والثانية في الحفاظ على هذا التركيز أثناء التجربة. بالنسبة للجهاز المحدد المستخدم في هذه الدراسة، يجب أن يتراوح حجم الخلايا أو الجسيمات بين 8 إلى 15 ميكرون لضمان الترتيب الكافي للتغليف المتحكم به. في هذا العرض التوضيحي، ستُستخدم كرات مجهرية من البولي دي أرجي (polys diary) بحجم 9.9 ميكرون كبدائل للخلايا؛ ولتحضير تركيز معلق الجسيمات المائي لتحقيق تغليف مثالي، ابدأ بتركيز مخزون من الكرات المجهرية بنسبة 1% من المواد الصلبة بالوزن باستخدام البيانات السابقة للترتيب الكامل. وكدليل إرشادي، قم بزيادة التركيز إلى 1.5% من المواد الصلبة عن طريق إجراء طرد مركزي لطيف لـ 1 مل من عينة المخزون، وإزالة 250 µL من السائل الطافي، ثم إعادة تعليق الجسيمات عن طريق الخلط بدوامة أو الخلط اللطيف.

عند استخدام الخلايا، يكون لكل من الخلايا وجسيمات البوليسترين كثافة نوعية أكبر من واحد، على الرغم من عدم توضيح ذلك في هذا الفيديو. بالنسبة للتجارب طويلة الأمد التي تستمر لعدة دقائق أو ساعات، يمكن موازنة قوة الطفو في المحلول عن طريق إضافة مذاب مثل كلوريد الكالسيوم للجسيمات أو opti prep للخلايا. بعد تجهيز معلق الخلايا أو الجسيمات، قم بتحضير عينة بحجم 10 milliliter من طور زيت الفلوروكربون المستمر في أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter باستخدام جهاز vortext.

امزج المادة الخافضة للتوتر السطحي وزيت الفلوروكربون بنسبة تقريبية تبلغ 2.5% وزناً/وزناً. في هذه الحالة، حصلنا على مزيج بنسبة 2.4 وزناً/وزناً، وهي نسبة مقبولة لإعداد تجربة التغليف الدقيق. أولاً، قم بتشغيل الطاقة للمجهر الضوئي المقلوب والكاميرا عالية السرعة.

ركز على طبقة القنوات الدقيقة وافحص القنوات بحثاً عن أي انسدادات أو شوائب قد تتحرك من مكانها. اختر قناة خالية من الشوائب الكبيرة أو الانسدادات الواضحة. قص ثلاثة أطوال من أنابيب tigon PVC الشفافة لمدخل المحلول المائي ومدخل الزيت ومخرج المستحلب لتقليل الحجم الميت إلى أدنى حد.

اقطع طولاً كافياً من الأنابيب ليصل من مضخات المحاقن إلى المجهر. اقطع نهايات الأنابيب بزاوية 45 درجة. ولتسهيل عملية الإدخال في المنافذ المائعية، استخدم الملاقط لتركيب نهايات الأنابيب بالضغط داخل هذه المنافذ. بعد ذلك، قم بتركيب إبرة محقنة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف غير مدبب بقياس 30 gauge بالضغط في الطرف الحر لأنبوب المدخل المائي.

كرر العملية لأنبوب إدخال الزيت. حرك الجهاز وثبّت الأنابيب على منصة المجهر باستخدام عدسة شيئية بقوة 20x، ثم قم بمحاذاة التركيز على فوهة الجهاز. اضبط المجهر يدويًا لتحقيق إضاءة كوهلر (Kohler illumination) لضمان توفير إضاءة مثالية عند المستوى البؤري.

باستخدام برنامج الكاميرا عالية السرعة، قم بقص مجال الرؤية حول الفوهة للسماح بمعدلات إطارات أعلى، ثم اضبط معدل الإطارات، وزمن التعريض، وإعدادات الكاميرا الأخرى حسب المتطلبات لضمان التسجيل الأمثل. بعد ذلك، املأ محقنة سعة 1 mL بمحلول الطور المائي المخلوط جيداً والمُحضّر مسبقاً. املأ محقنة سعة 3 mL بمحلول الطور الزيتي.

أَمِل إحدى المحاقن المعبأة رأسياً وقم بالنقر عليها لتحريك فقاعات الهواء باتجاه مخرج المحقنة. اضغط المكبس ببطء لفترة كافية لدفع الهواء إلى طرف المحقنة مع الإبقاء على المحقنة في وضع رأسي. صِل المحقنة بإبرة المحقنة المقابلة المثبتة مسبقاً في الجهاز.

اضغط على المكبس لدفع الهواء عبر الحجم الميت لإبرة السرنجة حتى يندفع السائل عبر الأنابيب وصولاً إلى الجهاز تقريباً، ثم ثبت السرنجة بإحكام في مضخة سرنجة وقم بتعشيق كتلة المكبس. كرر عمليات التوصيل للسرنجة الثانية وثبتها في مضخة سرنجة ثانية، ثم قم بتشغيل كل مضخة سرنجة وبرمجتها. وباستخدام بروتوكولات الشركة المصنعة، اضبط معدلات التدفق الأولية على 50 microliters per minute للطور الزيتي و5 microliters per minute.

بالنسبة لبداية الطور المائي، تنتظر المضخات دخول كل سائل إلى الجهاز وملء القنوات مع دفع الهواء المتبقي للخارج. قد يستغرق ذلك عدة دقائق باستخدام معدلات التدفق الأولية. لاحظ تكوّن القطرات عند الفوهة.

قم بزيادة معدل التدفق المائي ببطء لملاحظة ترتيب الجسيمات في قناة المحلول المائي الطويلة. ومع زيادة معدل التدفق، لا ترفعه إلى الحد الذي يؤدي إلى حدوث تدفق نفاث (jetting) للمجرى المائي عند الفوهة كما هو موضح في هذا المثال، ومع ملاحظة استخدام فوهة توليد قطرات مختلفة، فإن التدفق غير المستقر والقطرة غير المتناسقة يظهران هنا. إذا كان تركيز الجسيمات منخفضاً جداً بحيث لا يوفر سلاسل متبادلة مع عدد قليل نسبياً من الجسيمات المفقودة، ولم تكن العينة متوافقة من حيث الطفو، فقم بإمالة مضخة السرنجة فيزيائياً باتجاه مخرج السرنجة للسماح بترسيب تدريجي للجسيمات نحو مخارج السرنجة.

بمجرد حدوث ترتيب مناسب، قم بتعديل معدل تدفق الزيت لضبط تردد توليد القطرات وحجمها. قم بتعديل كلا معدلي التدفق بشكل تكراري لتحقيق معدلات التغليف وأحجام القطرات المطلوبة. وبمجرد التأكد من استقرار التغليف المنظم، انقل أنبوب المخرج من خزان النفايات إلى خزان تجميع لاستخدامه مستقبلاً.

يمكن تحقيق تغليف الجسيمات أو الخلايا الفردية والمزدوجة بكفاءة عالية. يُظهر استخدام هذا البروتوكول نتيجة نموذجية لتغليف جسيم واحد بمعدل تدفق زيتي قدره 60 microliters per minute ومعدل تدفق مائي قدره nine microliters per minute. تبلغ قيمة Lambda، وهي متوسط عدد الجسيمات لكل قطرة، 0.95.

تبلغ المسافة الفاصلة بين الجزيئات في اتجاه التدفق حوالي 17 إلى 18 ميكرون بالنسبة للجزيئات المتبادلة المرتبة كليًا. ويبلغ معدل توليد القطرات في هذا المثال 6.1 كيلوهرتز بمتوسط حجم قطرة قدره 24.4 بيكولتر. ويقارن المدرج التكراري كفاءة تغليف الجزيئات داخل القطرات في حالة تغليف الجزيئات الفردية المرتبة مع حالة الزيادة.

فيما يتعلق بالإحصائيات، بالنسبة للتغليف العشوائي لحجم عينة يبلغ 517 قطرة، كان متوسط كسر القطرات التي تحتوي على جسيم واحد هو 79.5% مقارنة بكسر تغليف عشوائي متوقع قدره 36.7%. ولوحظ أن كسر الجسيمات التي انتهى بها المطاف في القطرات المغلفة بشكل صحيح كان 83.7% لحجم عينة يبلغ 491 جسيماً، بينما كان كسر التغليف العشوائي 37.3%. يتم تحقيق تغليف الجسيمات المزدوج ببساطة عن طريق تقليل معدل تدفق الزيت إلى 30 µL/min مع الحفاظ على معدل التدفق المائي عند 9 µL/min. وهنا تكون lambda، وهي متوسط عدد الجسيمات لكل قطرة، 1.8. وهذا مشابه لتغليف الجسيم الواحد.

تبلغ المسافة الفاصلة بين الجسيمات في اتجاه التدفق حوالي 17 إلى 18 microns بالنسبة للجسيمات المتناوبة المرتبة كلياً. تبلغ متوسطات حجم القطرات الأكبر 39.8 picoliters وقد تشكلت بمعدل 3.8 kilohertz مقارنة بالتغليف العشوائي. وبالنسبة لحجم عينة مكون من 383 قطرة، فإن متوسط كسر قطرات التغليف المرتبة التي تحتوي على جسيمين هو 71.5%، مقابل كسر تغليف عشوائي متوقع قدره 26.8%. ولوحظ أن كسر الجسيمات التي استقرت في قطرات التغليف الصحيحة كان 79.5% لحجم عينة قدره 689 جسيماً، بينما كان كسر التغليف العشوائي 33.4%.

تظهر هذه النتائج مجتمعة أن كفاءات تغليف الجسيم الواحد والجسيم المزدوج تتفوق على كفاءات التغليف العشوائي بأكثر من ضعفين، وتؤدي إلى تقليل عدد القطرات التي لا تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا أو الجسيمات بشكل كبير. وتتضح أهمية التركيزات المناسبة للجسيمات أو الخلايا لتحقيق كفاءة تغليف عالية في هذه التجربة؛ فبينما تظل معدلات تدفق الزيت والمحلول المائي مطابقة لتلك المستخدمة في تجربة تغليف الجسيم المزدوج الموضحة سابقاً، تم خفض متوسط عدد الخلايا لكل قطرة lambda إلى 1.57.

وبناءً على ذلك، لا يحدث ترتيب كامل، وبالتالي تظهر فجوات في القطارات مما يترك قطرات شمسية تحتوي على جسيمات أقل من المتوقع. يوضح هذا المدرج التكراري انخفاض الكفاءة لتغليف جسيمين بسبب القيمة المنخفضة لـ Lambda. وبالنسبة لحجم عينة مكون من 324 قطرة، كان متوسط كسر القطرات التي تحتوي على جسيمين 55.9% مع وجود عدد من القطرات أحادية الجسيمات يقارب عدد القطرات ثنائية الجسيمات.

يشير هذا إلى أن قيمة Lambda يجب أن تكون مساوية أو قريبة من عدد الخلايا المرغوبة في كل قطرة لزيادة عدد الجسيمات أو الخلايا المغلفة بشكل صحيح إلى أقصى حد، مع اختيار القيمة الدقيقة لـ lambda بناءً على ما إذا كان من المقبول وجود عدد أقل أو أكثر من الخلايا في كل قطرة. وفي هذا العرض التوضيحي، نستغل عدم تطابق الطفو لتمكين التحكم في التركيز في الوقت الفعلي أثناء التجربة. ومع ذلك، بالنسبة للتجارب طويلة المدى، قد يكون من المستحسن تحقيق تطابق في الطفو للحصول على نتائج أكثر اتساقاً بعد تغليف الخلايا داخل قطرات مائية.

يمكن إجراء التجارب المعتمدة على الوقت في أنبوب طرد مركزي أو تحت المجهر عن طريق إعادة حقن القطرات في مصفوفات مائعة دقيقة.