أخذ العينات الإنسان Peptidome اللعاب الأصلية باستخدام مسبار الترشيح الفائق المصاصة، مثل: تبسيط وتعزيز الكشف الببتيد لقياس الطيف الكتلي السريرية

تستخدم هذه الدراسة لـ peptid اللعابي مسبار ترشيح فائق يشبه المصاصة متبوعاً بتحليل مباشر عن طريق مطيافية الكتلة nano lc LT Q. أولاً، يتم تجميع مسبار LLUF باستخدام غشاء من polyether cell phone وأنبوب من ethylene propylene. بعد ذلك، يتم جمع عينات اللعاب من المتطوعين ومعالجتها عبر مسبار LLUF لأخذ عينة من اللعاب.

بعد ذلك، انتقل مباشرة إلى قياس الطيف الكتلي nano L-C-L-T-Q وقم بتحليل البيانات المستمدة من عينات اللعاب مع وبدون المعالجة بمسبار LLUF. وفي النهاية، يمكن الحصول على ببتيدات اللعاب من خلال تحليل بيانات L-C-M-S-S ومقارنة الببتيدات المحددة بين العينتين. يوفر هذا النهج، الذي يستخدم مسبار ترشيح فائق يشبه المصاصة مقترنًا بتحليل مباشر بواسطة قياس الطيف الكتلي nano lc LTQ، مزايا رئيسية مقارنة بالطرق الأخرى مثل هضم بروتينات اللعاب إلى ببتيدات.

بعد ذلك، يجرى تحليل مطيافية الكتلة، حيث يعمل جهاز LUF PRO على تبسيط وتنقية اللعاب، كما يعزز من دقة رصد الببتيدات في اللعاب الكامل للتطبيقات السريرية. باستخدام غراء الإيبوكسي، يتم تثبيت أغشية البولي إيثر الخاصة بالهواتف المحمولة على حواف مجاديف البولي بروبيلين المثلثة. ثم يتم توصيل أنبوب من الفلورينيد إيثيلين بروبيلين (تيفلون) بفتحة الأسطوانة في المثلث.

قم بتعقيم مجسات مجداف البولي بروبيلين بكحول 70% طوال الليل، ولتقييم إحكام الغلق بشكل صحيح، اغمر مجسات LLUF في محلول Blue dextran بتركيز 50 milligrams per milliliter لمدة ساعتين. تأكد من خلو العينات التي تم جمعها من Blue dextran.

قم بتجنيد متطوعين أصحاء تتراوح أعمارهم بين 20 و40 عاماً. بعد غسل الفم بالماء، اطلب من الشخص بصق عينات من اللعاب الكامل في وعاء مبرد بالثلج. اجمع كافة العينات واحفظها على الثلج.

مباشرة بعد عملية الجمع، انتقل إلى غرفة درجة حرارتها 4 °C ومعك 200 µL من اللعاب لأخذ العينات باستخدام مجسات LLUF. الآن، انقع غشاء البولي إيثر في اللعاب البشري داخل طبق زراعة. قم بتوليد ضغط سلبي عن طريق سحب المحقنة لمحاكاة عملية الترشيح الفائق لأخذ العينات من اللعاب.

بعد ذلك، يتم تحديد تركيزات البروتين. قم بتحضير عينات بروتين اللعاب بتركيز 1 µg/µL لتحليلها بواسطة مطياف الكتلة المقترن بالكروماتوغرافيا السائلة النانوية (nano LC MS). ولتحليل العينات، نستخدم نظام exigent nano LC متصلاً عبر الإنترنت بمطياف الكتلة Finnegan LTQ. أولاً، يتم تحميل 5 µL من عينات اللعاب غير المهضومة في عمود المصيدة (trap column) لنظام nano LC بواسطة الموزع الآلي (auto sampler).

بعد خطوة الغسل، قم بتحويل الصمام وتمرير تدرج خطي من 0 إلى 50% من المنظم B إلى المصيدة وعمود الفصل C 18. باستخدام وضع الاعتماد على البيانات (data dependent mode) في جهاز Excalibur، اجمع أطياف ms ms لأقوى أربعة أيونات MS تتجاوز شدتها 1 × 10⁴. لكل عينة، قم بإجراء تشغيلات مكررة لثلاث تحضيرات منفصلة ومختلفة.

بعد ذلك، يتم استيراد ملف البيانات إلى نظام sequester sorcerer two، مع اختيار البحث في قاعدة بيانات بروتينات NCBI البشرية المناسبة باستخدام خاصية non enzyme specificity. وبعد إجراء بحث sequester، يتم تصفية النتائج والتحقق من صحتها وعرضها تلقائياً في peptide profit وprotein profit بناءً على نتائج sequester. ويقوم peptide profit بتقدير درجة احتمالية P شاملة لصحة تعيين الببتيد مقابل عدم صحته، كما يحدد معلومات إضافية حول كل تسلسل ببتيدي.

يحتسب "Protein profit" درجة احتمالية من صفر إلى واحد لكل بروتين بناءً على الببتيدات المخصصة لأطياف Ms.Ms. يحدد هذا القسم قدرة مجسات LLUF على إزالة البكتيريا الفموية من أجل مزرعة الكشف البكتيري، حيث تُوضع عينات اللعاب قبل وبعد جمع مجسات LLUF على أطباق آغار لاختبار البكتيريا الهوائية. تُستخدم أطباق آغار LB خالية من المضادات الحيوية عند 37 درجة Celsius لمدة يوم واحد، وبالنسبة للبكتيريا اللاهوائية، يُستخدم gas pack للاستنبات.

تم تحضين العينة في مرق bru على أطباق agar تحت ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد. يسهل تصنيع أجهزة الترشيح الفائق التي تشبه المصاصة عملية أخذ عينات من اللعاب في بيئة فموية محاكية. في هذا النظام، يتم لصق غشاء polyether سالب الشحنة بقطع وزن جزيئي 30 kilodaltons على مجداف من polypropylene ووضعه أمام مسبار LLUF لترشيح البروتينات الأكبر حجماً في اللعاب.

من أجل محاكاة بيئة الفم البشرية، يتم نقع إسفنجة في اللعاب باستخدام سرنجة. يتم ترشيح اللعاب وجمعه عبر أنبوب متصل. وقد أدى مقارنة الكروماتوغرامات السائلة (lc) للعاب قبل وبعد أخذ العينات باستخدام LLUF إلى تحديد الببتيدات اللعابية الأصلية بواسطة مطياف الكتلة nano L-C-L-T-Q.

بما أن هذه الكروماتوغرامات التفاضلية يتم اشتقاقها دون هضم كيميائي أو إنزيمي، فإنها تبسط عملية تحضير العينات للأغراض السريرية. وفي هذه العينة، بعد توضيح LLUF لتركيبات البروتين المختلفة، تم تحديد 131 ببتيداً في اللعاب غير المهضوم.

هذه الببتيدات هي شظايا مشتقة من بروتينات مختلفة غنية بالبرولين. الأكتين، وألفا أميلاز، وألفا-1 جلوبين، وبيتا جلوبين، وهيسوستاتين-1، والكيراتين، وميوسين-1، ومستقبل الغلوبولين المناعي البوليمري، والسيرين، وS 100. إن الببتيدات الفريدة الـ 26 التي تم تحديدها في اللعاب بعد الترشيح باستخدام مجسات LLUF هي شظايا مشتقة بشكل أساسي من بروتينات مختلفة غنية بالبرولين.

تم الكشف عن هذا الببتيد المشتق من alpha amylase حصرياً في عينة لعاب تم جمعها بدون استخدام مسابير LLUF، مما يوضح قدرة مسابير LLUF على إزالة البروتينات الكبيرة. والأكثر إثارة للاهتمام أنه بعد إزالة البروتينات الأكبر حجماً، أمكن الكشف عن عدة ببتيدات تسلسلية في اللعاب الذي تم أخذ عيناته بواسطة مسابير LLUF، وبالأخص تم تحديد الببتيدات ذات النهايات الكربوكسيلية (c termini) الغنية بالبرولين في العينات التي خضعت للترشيح الفائق باستخدام مسابير LLUF. يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية استخدام A-L-L-L-L-U-F PRO لتحضير اللعاب البسيط لتحليل الكتلة.

يُعد التحليل الأفضل أمراً بالغ الأهمية لجمع عينات اللعاب البسيطة تحت ظروف متسقة. وأعتقد أنه بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح خلال ثلاث ساعات. إن هذا النهج الذي يستخدم مسبار ترشيح فائق يشبه المصاصة مقترناً بتحليل direct nano L-C-L-T-Q-M-S، spectrum chain يسهّل التطبيقات السريرية للمؤشرات الحيوية في تشخيص الأمراض البشرية.