قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

تنتج هذه التقنية القياسية شرائح غطاء مطلية بـ gelatin موسوم فلوريسنتياً، وهي مناسبة لاختبارات التحلل الكمي لمصفوفة podium الغازية. بعد طلاء شرائح الغطاء بـ gelatin الموسوم فلوريسنتياً، يتم زرع الخلايا واستزراعها لتحليل تحلل المصفوفة. بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا وصبغها فلوريسنتياً لبروتينات علامات podia الغازية، ثم الحصول على الصور وقياس تحلل المصفوفة كمياً.

يمكن للنتائج النموذجية أن تحدد كمياً الاختلافات في تحلل المصفوفة الذي يتوسطه inv podia بين الخلايا التي خضعت لمعالجات مختلفة لجينات مختارة أو المعالجة بعوامل دوائية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن تحضير شرائح غطاء مطلية بالجيلاتين ذات تألق فلوري متجانس يصعب تحقيقه بسبب التغطية غير المتساوية للجيلاتين الفلوري أو التعامل غير السليم مع شرائح الغطاء المطلية بالجيلاتين. ستقوم الأستاذة المساعدة في الأبحاث Karen Martin، والزميلة في مرحلة ما بعد الدكتوراه Mandy Ammer، وطلاب الدراسات العليا Elise Walk وKaren Hayes وSteve Markwell باستعراض هذا الإجراء.

لتحضير المحلول المخزون من سكر السكروز والجيلاتين بتركيز 5% غير المُعلم، اخلط الجيلاتين والسكروز في PBS واتركهما ليذوبا تماماً عند 37 درجة مئوية. ثم يُخزن المحلول عند أربع درجات مئوية. انتقل بعد ذلك إلى تنظيف شرائح الغطاء الزجاجية.

ضع غطاء شريحة زجاجية منفردة في كل بئر من آبار طبق زراعة أنسجة بلاستيكي مكون من 24 بئراً، ثم أضف 500 microliters من حمض nitric بتركيز 20% إلى كل بئر واتركها للتحضين لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة محلول حمض nitric، اغسل أغطية الشرائح ثلاث مرات باستخدام ماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، قم بالطلاء.

ضع على كل شريحة غطاء 500 µL من polyol وlycine بتركيز 50 µg/mL، واحضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أزل محلول polylysine واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. يسهل طلاء Poly L lysine عملية التغطية والارتباط المتساوي للجيلاتين المسمى الذي يوضع فوقه. ضع أطباق ذات 24 بئراً على الثلج وأضف 500 µL من glutaraldehyde بتركيز 0.5% المحضر حديثاً إلى كل بئر.

قم بتحضين الأطباق على الثلج لمدة 15 دقيقة. أجرِ ثلاث غسلات باستخدام PBS بارد، ثم اشفط جميع آثار PBS قبل طلاء الجيلاتين. وفي هذه الأثناء، وأثناء التحضين باستخدام الجلوتارالدهيد، قم بإعادة تكوين الجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 4 88.

وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، قم بتدفئة المحلول والمحلول المخزون من سكر السكروز والجيلاتين بتركيز 5% غير المسمى حتى 37 °C. ثم قم بتخفيف 500 µL من الجيلاتين المسمى في أربعة ملليلتر من الجيلاتين غير المسمى. وباستخدام الماصة، ضع 100 µL من خليط الجيلاتين المخفف 4 88 على كل شريحة غطاء.

استخدم كمية كافية من الجيلاتين لتغطية غطاء الشريحة دون الحاجة إلى التوزيع اليدوي. ومن المهم الحفاظ على خليط جيلاتين 4 88 المخفف عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء عملية التغطية لمنع التصلب المبكر. كما يجب، بدءاً من هذه الخطوة، الاحتفاظ بأغطية الشرائح في الظلام قدر الإمكان لتجنب احتمالية حدوث التبييض الضوئي.

بمجرد تغطية جميع شرائح الغطاء في لوحة واحدة، أمسك اللوحة بزاوية وقم بإزالة الجيلاتين الزائد من كل بئر عن طريق الشفط بالتفريغ. ثم قم بتحضين شرائح الغطاء المطلية في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل شرائح الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS، أضف 500 microliters من sodium burrow, hydride, sodium burrow.

يتميز هيدريد الصوديوم بكونه فواراً، وستظهر فقاعات صغيرة على وغطاء كل شريحة غطائية وبجوارها؛ يتم التحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاختزال وتعطيل بقايا الغلوتارالدهيد. يتم إزالة محلول Sodium borohydride عن طريق الشفط الفراغي بحركة مسح سريعة حول المحيط الخارجي لكل بئر، مع الحرص على عدم سحب أي شرائح غطائية طافية قد انفصلت عن قاع طبق زراعة الأنسجة أثناء المعالجة بـ Sodium borohydride. بعد ثلاث غسلات بمحلول PBS، تُحضن الشرائح الغطائية في ethanol بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام تقنية تعقيم، انقل شريحة الغطاء التي تحتوي على الصفائح إلى غطاء تدفق صفائحي لزراعة الخلايا من النوع B، واشطف شرائح الغطاء ثلاث مرات بمحلول PBS معقم باستخدام إبرة وملقط معقمين. انقل شرائح الغطاء بعناية إلى بئر فارغ في صفيحة جديدة ذات 24 بئراً، وقم بموازنة شرائح الغطاء مع وسط الزراعة الخاص بنوع الخلايا المستخدم.

قم الآن باستزراع الخلايا مباشرة على شرائح التغطية بعد فترة تحضين مناسبة. قم بمعالجة العينات للتصوير المناعي الفلوري من أجل تثبيت العينات. ضع قطرة من مادة prolonged gold anti fade أو كاشف مماثل على شريحة مجهرية، ثم ضع شريحة التغطية المقلوبة بعناية، والتقط الصور اللازمة للتحليل.

يوفر هذا التحليل المساحة المعيارية لتحلل المصفوفة بالنسبة لمساحة الخلايا أو عددها. وهو مفيد لتحليل كامل المجالات المجهرية التي تظهر فيها خلايا متعددة عولجت جماعياً بعوامل نمو irna أو بعوامل علاجية. وبالنسبة لهذا التحليل، يتم جمع الصور بتكبير منخفض يكفي لجمع معلومات كافية عن مجموعات الخلايا بكفاءة.

افتح الصورة في برنامج ImageJ. تحقق من معلومات المقياس وحدد القياسات. اختر خياري المساحة (area) والحد الأدنى للعتبة (limit to threshold). احسب مساحة التحلل باستخدام صورة الجيلاتين الفلورية، مع تصحيح عدم استواء الإضاءة عبر الجيلاتين عن طريق طرح عتبة الخلفية، والصورة لتعيين قيم كثافة البكسل العليا والسفلى.

في الصور اللاحقة، استخدم زر الضبط (set) في نافذة العتبة (threshold window) لتعيين العتبة نفسها لجميع الصور كوسيلة موضوعية لتحديد منطقة التحلل. استخدم وظيفة تحليل الجسيمات (analyze particles) لقياس العتبة في مناطق تحلل المصفوفة.

اختر حجماً للجزيئات أكبر من صفر لإزالة الضوضاء من التحديد. قم بتفعيل خيار إظهار المخططات الخارجية لتحديد المناطق ذات الأهمية. ثم قم بتفعيل خياري عرض النتائج والتلخيص لإظهار القياسات إذا كان الرسم قد حدد بدقة جميع مناطق التدهور.

انسخ قياس المساحة الكلية في جدول بيانات، وفي حال تم تحديد أجسام أخرى، مثل الحطام، سجل فقط مساحات المناطق ذات الصلة. بعد ذلك، ولحساب مساحة الخلية، افتح ملف الصورة المصبوغة وقم بتطبيق عتبة الصورة (threshold) لضبط قيم كثافة البكسل العليا والدنيا بحيث يتم تحديد حواف الخلايا في الصور اللاحقة. استخدم زر الضبط (set) في نافذة العتبة لتعميم نفس العتبة على جميع الصور.

كوسيلة موضوعية لتحديد منطقة الخلايا، استخدم وظيفة "تحليل الجسيمات" (analyze particles) لقياس حد مساحة الخلايا. اختر حجم جسيمات أكبر من صفر لإزالة الضجيج من التحديد.

اعرض المخططات التفصيلية لتحديد المناطق المراد تحليلها، ثم تحقق من نتائج العرض ولخّص النتائج لإظهار قياسات المساحة. لا تفعّل خيار التحقق. قم بتضمين الثقوب في حال وجود مسافات بين الخلايا والتكتل.

الآن قم بالاختيار. حسناً، انسخ نتائج المساحة للمناطق ذات الأهمية ذات الصلة إلى جدول بيانات واحسب مساحة تحلل الجيلاتين بالنسبة للمساحة الكلية للخلايا. وهناك نهج بديل يتمثل في تطبيع مساحة التحلل بالنسبة لعدد الخلايا كما يتم تحديده عن طريق عد نوى صبغة DAP e.

يُعد هذا الأمر مهماً إذا كانت المعالجات تؤدي إلى تغيير متوسط مساحة الخلية. وفي هذا النهج، استخدم إضافة عدّ النواة (nucleus counter plugin) لعدّ النوى تلقائياً. قم بتعديل الخيارات لتحسين النتائج بما يتناسب مع صورك. وفي حال تداخل النوى بشكل كبير، قد لا يوفر العد التلقائي تعداداً دقيقاً في هذه الحالة.

يمكن تسهيل عملية العد اليدوي باستخدام ملحق عد الخلايا عند تنفيذه بشكل صحيح. تُطلى شرائح التغطية بشكل متساوٍ بـ gelatin المقترن بـ Oregon Green 4 88. قد تظهر عدة شوائب اصطناعية أثناء طلاء ومعالجة شرائح التغطية المطلية بـ gelatin.

على سبيل المثال، ينتج الطلاء غير المتجانس عن التغطية غير الصحيحة للشريحة الغطائية أثناء عملية الطلاء بسبب ضعف الخلط، أو الفرد اليدوي، أو التصلب الجزئي لمزيج الجيلاتين. وتشير الخدوش إلى إزالة المصفوفة المطلية عن طريق التخدش بالإبر أو الملاقط أثناء التعامل. كما يمكن أن يؤدي جفاف سطح الشريحة الغطائية خلال فترات التخزين الطويلة إلى ظهور مظهر يشبه رصيف الحجر. وتعكس هذه المنطقة حدوث تبييض ضوئي لسطح الجيلاتين الفلوري أثناء التصوير نتيجة التعرض للضوء لفترات طويلة أو بكثافة عالية.

لاحظ كيف تظهر شريحة غطاء مُعدة جيداً فلورية متجانسة عند فحصها بالمجهر. وتوفر المصفوفات الرقيقة الناتجة عن هذا الإجراء وسيلة حساسة لتقييم قدرة الخلايا على تحليل الـ ECM. على سبيل المثال.

تُظهر هذه الصور نشاط تحلل مصفوفة المنصة الغازية لخلية سرطان الرأس والعنق من نوع OSC 19. هنا، تم استزراع الخلايا على شريحة غطاء من الجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 4 88، وصُوّرت بواسطة المجهر الفلوري كما هو موضح في الصور ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D). وقد تم وسم خلايا OSC 19 المستزرعة على شرائح غطاء الجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 4 88 باستخدام Rhodamine المقترن بـ Phalloidin وأجسام مضادة لـ cort actin، والتي تم تصورها باستخدام جسم مضاد ثانوي من نوع ANOR 6 47، ولُوِّنت الغزو باللون الأخضر الكاذب.

تظهر الأقدام الكاذبة (Podia) بوضوح في الصورة المدمجة كتركيزات سيتوبلازمية بؤرية من F actin و cortan التي تتداخل مع مناطق حجم ملء التصفية في الجيلاتين. ويصور العرض المرئي كيفية اختراق الأقدام الكاذبة الغازية في الحجم الفرعي لـ ECMA، حيث تم إنشاء هذا العرض لإظهار حافة داخل الخلية حيث تتواجد الأقدام الكاذبة الغازية. كما يوضح عرض الحافة الظهرية الأقدام الكاذبة الغازية وهي مغروسة في الجيلاتين الأساسي.

يُظهر عرض الحافة البطنية وجود بروزات في أقدام Veda ومناطق من تحلل الجيلاتين أسفل غطاء الشريحة، حيث تظهر المناطق الحمراء داخل المصفوفة الخضراء. توضح هذه الصور بعض الخطوات المهمة لتقدير كمية تحلل مصفوفة الجيلاتين الموحدة للخلايا ضمن صورة مجهرية كاملة. وقد تم تحويل جميع الصور الفلورية إلى التدرج الرمادي لعرض عمليات تحديد العتبة الحمراء وعلامات منطقة الاهتمام بشكل أفضل.

تُظهر هذه الصورة للجيلاتين المقترن بـ Oregon Green 4 88 المناطق الداكنة التي حدث فيها تحلل. ومن خلال عملية تحديد العتبة (Thresholding) لصورة الجيلاتين، يتم إبراز مناطق التحلل التي تُقاس منها مناطق اهتمام مختارة لتقدير مساحة التحلل. وتُظهر هذه الصورة الرمين (rumine) والفُوئيد (foid) وصبغ f actin كما هو متوقع.

توضح صورة العتبة عند مستوى الأكتين (actin) إجمالي مساحة الخلية التي يتم من خلالها اختيار مساحات الخلايا المراد قياسها. وبالمثل، يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة صور أنوية الخلايا المصبوغة بـ DAPI. توضح هذه اللوحة خطوات مختارة تتضمن قياس تحلل الجيلاتين الفلوري بواسطة خلايا فردية ضمن مجموعة خلوية مختلطة.

يعد هذا القياس الكمي البسيط لخلية واحدة من خلايا OSC 19 التي تم تحويلها جينياً للتعبير المفرط عن بروتين cort actin المؤتلف والمدمج مع وسم flag الإبيتوپي. لاحظ كيف يمكن أيضاً تحليل تحلل المصفوفة بواسطة الخلايا المحولة جينياً ضمن مجموعة مختلطة من الخلايا المحولة وغير المحولة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدة أمور.

أولاً، تأكد من أن الواسمات الخلوية الفلورية لا تتداخل مع لون الجيلاتين الفلوري. وعند جمع الصور، من المهم اختيار الحقول بناءً على وجود الخلايا. لا تبحث بشكل تفضيلي عن مناطق التحلل لأن ذلك قد يؤدي إلى تحيز البيانات بسبب التباين بين الخطوط الخلوية والاستجابات لمختلف العوامل العلاجية.

يجب تحسين عوامل مثل وقت تحلل عدد المقاعد واختيار البروتين للوسم المناعي الفلوري بما يتناسب مع تجربتك المحددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء شرائح غطاء مغطاة بالتساوي بجلاتين فلوري من مقايسات التحلل التي تتوسطها beta podia، بالإضافة إلى طرق تقدير التحلل المصفوفي كمياً.