دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

يهدف هذا الإجراء إلى مراقبة كيف يتحكم التحلل البروتيني لـ cycling B في بدء طور انفصال الكروماتيدات والنهاية الانقسامية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع خلايا cycling B snap reporter على شرائح مجهرية. وتتمثل الخطوة الثانية في وسم جزيء Cyclin B snap reporter الكيميري باستخدام الركيزة الفلورية TMR star.

بعد ذلك، يتم الحصول على سلسلة الصور في محطة المجهر. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل الخلايا وحساب شدة فلورية TMR star بمرور الوقت، والتي تعكس تحلل البروتين cycling B. وفي النهاية، يكشف المجهر الفلوري المناعي للخلايا المراسلة الحية عن حركية تحلل البروتين cycling B التي تحدث أثناء الانقسام الفتيلي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مراقبة cyclone BGFP، في أن cyclone B SNAP تتيح مراقبة تحلل cyclone B بدلاً من التعبير البروتيني الكامل. في هذه التجربة، تُترك خلايا snap reporter في البداية لتنمو بشكل غير متزامن في مرحلة النمو اللوغاريتمي (log phase) لمدة 48 ساعة على الأقل. وللبدء، يتم اتباع إجراء استخدام التربسين لزراعة خلايا snap reporter في حالة دون الاندماج الكامل (sub confluence)، وذلك لتوزيع الخلايا على غرف مجهرية ذات ثماني آبار بتوزيع ثابت عبر السطح الكامل لجهاز الطرد المركزي الخاص بالغرفة.

قم بتعليق 10,000 خلية في 350 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر. انقل معلق الخلايا إلى حجرة المجهر لاستزراع الخلايا في حجرات مجهرية مكونة من ثماني آبار، مع ضمان وصول كثافة الخلايا إلى حدها الأقصى في مركز الحجرة. أولاً، املأ الحجرة بـ 300 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر.

بعد ذلك، أضف 5,000 خلية بعناية إلى مركز حجرة المجهر لزراعة الخلايا في أطباق بصريات خاصة ذات 96 بئراً، لضمان توزيع ثابت عبر كامل سطح البئر. قم بطرد 5,000 خلية مركزياً وأعد تعليقها في 300 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر، وذلك بناءً على العدد الإجمالي المطلوب للآبار التي تحتوي على خلايا. اضبط عدد الخلايا والحجم الإجمالي لوسط التعليق.

بعد ذلك، يتم نقل معلق الخلايا إلى طبق يحتوي على 96 بئراً لزراعة الخلايا في أطباق بصرية خاصة مكونة من 96 بئراً، مع ضمان أقصى كثافة للخلايا في مركز البئر. أضف بعناية 1,500 خلية في 15 µL من وسط نمو عادي خالٍ من الفينول الأحمر على شكل قطرة صغيرة في مركز كل بئر.

سيؤدي ذلك إلى حصر نمو الخلايا في مركز البئر. اترك جميع الخلايا المزروعة تنمو لمدة 18 ساعة على الأقل في ظل ظروف زراعة الخلايا القياسية قبل 30 دقيقة من بدء إجراء التلوين. قم بتدفئة كميات من وسط نمو عادي خالٍ من الفينول الأحمر إلى 37 °C.

الركيزة المستخدمة في هذا العرض التوضيحي هي TMR star لسهولة التعامل؛ يتم إذابة TMR star في DMSO للحصول على محلول مخزون بتركيز 400 micromolar، ثم يُخفف 0.5 microliters من المحلول المخزون لـ TMR star في 200 microliters من وسط نمو طبيعي دافئ وخالٍ من الفينول الأحمر للحصول على تركيز وسم نهائي قدره 1 micromolar. بعد ذلك، يتم إزالة وسط النمو الطبيعي من الخلايا التي تنمو بشكل غير متزامن واستبداله بوسط الوسم، ثم تُحضن الخلايا في وسط الوسم لمدة 25 دقيقة تحت ظروف الزراعة القياسية.

بعد 25 دقيقة، قم بإزالة وسط الوسم واغسل الخلايا أربع مرات باستخدام وسط نمو طبيعي دافئ وخالٍ من الفينول الأحمر. بعد الغسلة الأخيرة، قم بتحضين الخلايا في 300 microliters من وسط نمو طبيعي دافئ وخالٍ من الفينول الأحمر لمدة 30 دقيقة قبل نقلها إلى المجهر. استبدل الوسط بوسط نمو طبيعي جديد ودافئ وخالٍ من الفينول الأحمر لإزالة بقايا ركيزة snaps غير المرتبطة، وانقل الخلايا إلى المجهر في صندوق من البوليسترين على كتلة تسخين مسخنة مسبقاً عند 37 degree Celsius.

لتقليل تباين درجات الحرارة قبل ساعتين من قياس شدة الفلورة، اضبط درجة حرارة الهواء في غرفة التحكم المناخي على 37 °C في الوضع الجاف من أجل إيصال المجهر وجميع مكوناته إلى درجة الحرارة المطلوبة. ولتجنب التكثف وما يتبعه من تلف للمجهر، من المهم القيام بالتسخين المسبق قبل ضبط الرطوبة.

عندما يصل نظام المجهر بالكامل إلى 37 °C، اضبط رطوبة الهواء على 60% وثاني أكسيد الكربون على 5%. ابدأ تشغيل برنامج المسح أو الحصول على الصور وحدد الإعدادات القياسية. حدد مواقع الآبار المراد تحليلها. حدد قيمة delta T أو زمن دورة الحصول على الصور، والعدد المطلق لدورات الحصول على الصور.

في هذا العرض التوضيحي، يتم تحديد التركيز التلقائي للأجهزة (Hardware autofocus) مسبقاً لتحليل عدد أكبر من الآبار. ابدأ عملية الاستحواذ وراقب أول دورتين من دورات الاستحواذ.

سيركز المجهر على إشارة GFP لبروتين الهيستون H2، مع التقاط صورة أولى في هذه القناة قبل تغيير المرشح والتقاط صورة TMR star المقابلة. وتتكرر هذه العملية لجميع المواقع داخل البئر الواحدة ولكل بئر من الآبار المراد فحصها قبل تكرار الدورة التالية مرة أخرى. ولتحليل ملفات التحلل البروتيني، قم بتشغيل برنامج تحليل scan R.

قم بتحليل الصور التي تظهر نوى الخلايا كما تم تصويرها بواسطة histone H two GFP، مع تحديدها ككائن رئيسي باستخدام عتبة تعتمد على شدة الإشارة وخوارزمية watershed للمساعدة في فصل الخلايا المتجاورة. يجب إنشاء كائن فرعي يتكون من النواة مع السيتوبلازم لتحليل TMR star. وتتمثل الخصائص الهامة للكائن الرئيسي في الموضعين X وY، والزمن، والشدة القصوى والمتوسطة لـ GFP للكائن الرئيسي، والشدة الكلية مقسومة على المساحة.

بالنسبة للكائن الفرعي TMR star، قم بالتغيير إلى وضع التتبع (trace mode) لتصور متوسط شدة فلورة TMR star للكائن الفرعي بمرور الوقت أو تتبعات الخلايا المخصصة للكائنات الرئيسية التي تم تحليلها. تتيح مراقبة أعداد أكبر من الخلايا رؤية تمثيلية وموضوعية أولية، ولكن يمكن تضييق نطاق عدد الخلايا المراد فحصها عن طريق تحديد القياسات التي تستمر لـ 140 cycles على الأقل وتحتوي على شدة قصوى عالية لـ histone H two GFP. اختر تتبع خلية محل اهتمام لتصور فلورة histone H two GFP وTMR star في وقت واحد على مستوى الخلية الواحدة.

باستخدام الزر الأيمن للفأرة، انقر فوق الخلية المطلوبة لإنشاء صورة قابلة للتصدير. معرض توضيحي لبروتين histone H2 GFP وبروتين cyclin B snap TMR* لكل نقطة زمنية. قم بتحويل برنامج تحليل الماسح الضوئي إلى وضع التجمعات (population mode)، ثم حدد المنطقة التي تظهر فيها الخلية المطلوبة في مخطط النقط (dot blot).

قم بتطبيق نافذة مخطط نقطي (dot plot) جديدة على المنطقة المحددة، ثم قم بتصور متوسط شدة فلورة TMR star بمرور الوقت. قم بتصدير البيانات إلى برنامج Microsoft Excel لإجراء المزيد من الحسابات. توضح الأشكال هنا حركية Cyclin B المتمثلة في منحنى شدة فلورة TMR star لخلية تمر بمرحلة انقسام ميتوزي منتظم دون ظهور علامات على عدم محاذاة الكروموسومات عند تكثيف السيتوبلازم عقب تحلل الغلاف النووي أو NEBD كما يشير المثلث الأحمر، حيث تظهر شدة فلورة TMR staph زيادة مفاجئة حتى الوصول إلى النافذة المتماثلة.

عندما تدخل الخلية في طور前مؤخّر (prometaphase)، تظل شدة الفلورة عند مستوى مستقر طوال تقدم الخلية عبر الطور التمهيدي والطور الاستوائي، ثم تبدأ في الانخفاض سريعاً. وبمجرد أن تشكل جميع الكروموسومات صفيحة استوائية مستقرة، يسبق هذا الانخفاض عملية انفصال الكروموسومات. وخلال الطور الانفصالي، الذي تشير إليه النقطة الزرقاء على المنحنى في مرحلة متأخرة من الانقسام الفتيلي، يبدأ الكروماتين في فك التكثيف وتتخذ الخلية شكلاً مورفولوجياً مميزاً للمرحلة البينية.

بينما يقترب منحنى شدة الفلورة من مرحلة الثبات، والتي تكون أدنى من مرحلة الثبات التي تسبق الانقسام الفتيلي بعد تطوره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الانقسام الفتيلي لاستكشاف التوازن الدقيق بين الدورة والتحلل والاصطناع الذي ينظم التقدم في عملية الانقسام الفتيلي.