ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

الهدف العام من التجربة التالية هو تقديم طريقة تحضير قوية للحويصلات الدهنية ذات الصلة بيولوجياً. ويتم تحقيق ذلك عن طريق خلط ونقل الفسفوليبيدات إلى قوارير زجاجية وترطيبها بمحلول منظم مائي لإنشاء معلق SLE متعدد الطبقات. وكخطوة ثانية، يتم تنفيذ طريقة التجميد والإذابة، والتي تؤدي لاحقاً إلى إنتاج حويصلات Ella من الحويصلات متعددة الطبقات.

بعد ذلك، يتم تمرير معلق الليبوزوم عبر جهاز البثق باستخدام الضغط الأمثل المحدد لإنتاج حويصلات دهنية متجانسة بالحجم المطلوب. وقد تم الحصول على نتائج تظهر أحجام حويصلات دون ميكرونية متسقة بناءً على تشتت الضوء الديناميكي وتحليل تتبع الجسيمات النانوية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المعالجة بالموجات فوق الصوتية والترسيب، في أن هذه الطريقة تستخدم نظام تحكم في الضغط مع معدلات تدفق نيتروجين مثلى محددة لتحضير أحجام الحويصلات الدهنية بكفاءة.

لبدء هذا الإجراء، أحضر قارورة زجاجية سعة 20 milliliter بغطاء مبطن بالتفلون، وقم بتنظيف جميع الأدوات الزجاجية والمحاقن باستخدام الكلوروفورم قبل الاستخدام لمنع التلوث. انقل 100 µL من الكلوروفورم بدرجة نقاء كاشف إلى القارورة الزجاجية باستخدام محقنة زجاجية محكمة الإغلاق سعة 250 µL. أضف 30 µL من الميثانول بدرجة نقاء كاشف إلى القارورة الزجاجية نفسها باستخدام محقنة زجاجية محكمة الإغلاق سعة 100 µL.

قم بتحضير محلول دهني من POPC والكوليسترول بتركيز 2 ملي مولار عن طريق نقل 216 µL من محلول POPC بتركيز 10 mg/mL، و 42 µL من محلول POPE بتركيز 10 mg/mL، و 20 µL من محلول الكوليسترول بتركيز 11 mg/mL إلى وعاء زجاجي سعة 20 mL. قم بتبخير المذيبات العضوية باستخدام تدفق بطيء من غاز الأرجون أو النيتروجين حتى يتكون غشاء رقيق من الدهون في قاع الوعاء، ثم ضع الوعاء الزجاجي غير المغطى في مجفف تفريغ لمدة 30 دقيقة على الأقل.

لإزالة المذيب المتبقي، انقل 2 mL من المحلول المنظم الذي تم تمريره مسبقاً عبر مرشح بمسامية 0.2 micron إلى القارورة الزجاجية لترطيب الدهون. قم بحضن الخليط عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل، واستخدمه في غضون 48 ساعة في حالة كانت أحجام الليبوزومات تتراوح بين 30 إلى 100 nanometers. جمد معلق الليبوزومات في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية.

بعد ذلك، قم بإذابة معلق الليبوزوم باستخدام كتلة تسخين عند 42 degrees SIUs لمدة ثلاث دقائق تقريبًا. كرر عملية التجميد والإذابة لخمس دورات إجمالاً. تؤدي عملية التجميد ثم الإذابة إلى إنتاج Ella Les من الحويصلات متعددة الطبقات وتعزز كفاءة احتجاز الدهون أثناء البثق.

بعد ذلك، استعد لعملية البثق باتباع تعليمات Avastin لتجميع جهاز lipo so fast. LF 50 extruder بعناية؛ حيث يعد التجميع الصحيح أمراً بالغ الأهمية لمنع تسرب النيتروجين، مما يؤثر على معدلات التدفق المطلوبة. ولضمان النجاح، قم بتنفيذ الخطوات التالية بدقة.

لإنشاء سداد محكم للهواء، ضع شاشة دعم الثقوب الكبيرة في قاعدة مرشح الدعم، يتبعها الطبق المركزي الدائري، وقرص تصريف واحد، وغشاء بولي كربونات واحد. ضع الحلقة الدائرية السوداء الصغيرة (O-ring) فوق الغشاء وثبتها في قاعدة مرشح الدعم.

قم بتثبيت وحدة بثق المرشح العلوية عن طريق ربط أربعة براغي في الثقوب الأربعة المقابلة. قم بتجميع وحدة بثق المرشح أسفل أسطوانة البثق الكبيرة. أضف محلول الليبوزوم إلى أسطوانة الأسطوانة الموجودة فوق أسطوانة البثق.

ضع حلقة دائرية O-ring كبيرة، وغطاءً ضيقاً، وحلقة دائرية O-ring كبيرة، وغطاءً دائرياً. قم بتركيب منظم الغاز في الجزء العلوي من أسطوانة الباثق وأغلق جميع الصمامات لمنع تسرب الهواء، بما في ذلك صمام تنفيس الضغط. ضع قارورة زجاجية سعة 20 milliliter أو دورق إرلنماير سعة 50 milliliter أسفل وحدة ترشيح الباثق.

يتصل صمام أمان بالمنظم ويقوم بالتنفيس إذا تجاوز الضغط 600 PSI. أقوم بتشغيل غاز النيتروجين وفتح صمام الغاز المتصل بجهاز البثق. يتم زيادة ضغط النيتروجين إلى 25 PSI لإنتاج ليبوزومات بحجم 400 nanometer، وإلى 125 PSI لليبوزومات بحجم 100 nanometer، ومن 400 إلى 500 PSI لليبوزومات بحجم 30 nanometer. يتم مراقبة معلق الليبوزومات حتى يتم دفعه بواسطة النيتروجين وخروجه إلى الحاوية.

استمر في تدفق النيتروجين حتى لا يُلاحظ وجود أي سائل. يتم التمرير عبر مرشح البثق إلى الملف الزجاجي لإجراء تحليل DLS. أولاً، قم بتحضير 50 µL من محلول ليبوزوم بتركيز 20 µM مخفف في محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS.

بعد ذلك، قم بتشغيل مصدر الطاقة ومصدر المصباح. ابدأ بفتح برنامج dynapro، ثم اضبط البرنامج على نموذج الخوارزمية المخصص للكشف عن الليبوزومات بالحجم المطلوب.

بعد التوصيل بالجهاز، اسحب 14 µL من عينة الليبوزوم باستخدام الماصة وضعها في وعاء الكوارتز ثم أدخلها في حامل الخلية، واضغط على زر البدء؛ وبعد إجراء ما يقرب من 20 إلى 30 عملية استحواذ، اضغط على زر الإيقاف. قم بتحليل قمم متوسط قطر الليبوزومات المسجلة في المخطط التكراري. يبدأ تحليل تتبع الجسيمات النانوية بتحضير 500 µL من محلول ليبوزوم بتركيز 0.1 µM المذاب في PBS، ثم اشطف حجرة العينة بالماء والإيثانول.

بعد ذلك، جفف حجرة العينة باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر. قم بتشغيل مصدر طاقة الليزر وجهاز الكمبيوتر، ثم ضع 300 µL من محلول الليبوزوم بتركيز 0.1 molar في حجرة العينة. افتح نظام التحكم في درجة الحرارة وبرنامج تحليل تتبع الجسيمات النانوية.

اضغط على زر الالتقاط لتشغيل الليزر. استخدم تعديلات الضبط الأفقي والرأسي لتحريك المنصة وضبط بؤرة المجهر. حدد درجة الحرارة ووقت التسجيل المطلوبين.

اضغط على زر التسجيل لالتقاط إطارات صور متعددة لجزيئات الليبوزوم لفترة زمنية محددة. قم بتحليل القمم المقابلة لأقطار أحجام الليبوزوم في المدرج التكراري بينما يتتبع حركة كل جزيء. يُعد تشتت الضوء الديناميكي (DLS) طريقة معتمدة تقوم بجمع الضوء المشتت لتحديد قطر الجزيئات، وقد أُجريت هذه العملية لتحديد أحجام الليبوزوم.

تم بثق الليبوزومات المميّهة عبر أغشية بولي كربونات بأحجام وضغوط مختلفة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وكانت أقطار الليبوزومات التي تم قياسها بواسطة DLS لحجم مسام 30 nanometer هي 66 ± 28 nanometers. وبالنسبة لحجم مسام 100 nanometer كانت 138 ± 80 nanometers، ولحجم مسام 400 nanometer كانت 360 ± 25 nanometers.

استُخدم معلق من حبيبات Irene المصقولة بحجم 50 نانومتر كمعيار للمعايرة، حيث سجل قطرًا قدره 47 ± 16 نانومتر. وتوضح نسبة التشتت المتعدد عدم وجود تداخل في أحجام الليبوسومات. ومن الشائع ملاحظة أقطار تزيد عن 30 نانومتر عند استخدام تحليل DLS نظرًا للانحياز المعروف لهذا الجهاز تجاه الجسيمات الأكبر حجمًا.

على الرغم من هذا القيد في الجهاز، يصف منحنى المعايرة ارتباطاً خطياً. يعد تحليل تتبع الجسيمات النانوية تقنية جديدة تقيس حجم كل جسيم من خلال الملاحظات المباشرة للانتشار في وسط سائل بشكل مستقل عن معامل انكسار الجسيم أو كثافته. يمكن استخدام هذه التقنية عالية الدقة لاستكمال قياس الليبوزومات باستخدام DLS؛ حيث سجلت NTA أقطاراً بلغت 95 ± 48 nanometers و 356 ± 51 nanometers لمحلولين من البوليسترين بحجم 100 nanometer و 400 nanometer استُخدما للمعايرة.

تتمتع المحاليل الدهنية بقطر أكثر قابلية للمقارنة بالنسبة لتقنية DLS، حيث أنتجت أحجاماً متوسطة تبلغ 29 ± 14 nanometers لحجم مسام 30 nanometer، و95 ± 17 nanometers لحجم مسام 100 nanometer، و359 ± 73 nanometers لحجم مسام 400 nanometer. وقد تكون تقنية NTA أداة توصيف أكثر عمومية لتقدير الجسيمات المجهرية نظراً لأن حساسيتها تسمح بقياس الجسيمات التي يتراوح حجمها من 50 إلى 1000 nanometers. ويظهر منحنى المعايرة ارتباطاً خطياً بين مسام غشاء البولي كربونات مقابل قطر NTA المسجل. كما تظهر صور المجهر الإلكتروني النافذ بالصبغة السالبة أن أحجام الليبوزومات بعد البثق بأحجام 3 و100 و400 nanometers متميزة بوضوح عن بعضها البعض.

تم ضبط التكبير على 25,000 مرة مع شريط مقياس يمثل 0.5 microns. أُجريت تجربة تتبع زمني باستخدام ثلاثة أحجام من الليبوزومات. تم قياس DLS لكل محلول ليبوزوم مباشرة بعد عملية البثق.

خُزنت جميع محلول الليبوزوم عند درجة حرارة أربع درجات Celsius طوال الليل. وسُجلت أقطارها مرة أخرى بواسطة DLS بعد تحضينها طوال الليل. لُم يلاحظ وجود تغيير يذكر أو لم يلاحظ أي تغيير بعد فترة تحضين استمرت 60 ساعة. عند تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن التمرير المتعدد عبر مرشح البثق سيعمل على تحسين تجانس محلول Vesco.

تذكر أيضاً استخدام قوارير ومحاقن زجاجية لتحضير العينات، وذلك لمنع حدوث تلوث ناتج عن ترشح مواد من أنابيب البولي بروبيلين بفعل الكلوروفورم.