نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية

الهدف من هذا الإجراء هو تعريض الخلايا المستنبتة ثلاثية الأبعاد (3D) لتدفق السائل الخلالي، وقياس التأثيرات التي يحفزها التدفق على غزو الخلايا. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير محلول هلامي يتكون من كولاجين من النوع الأول وMatrigel. وتتمثل الخطوة الثانية في إضافة تركيز محدد من الخلايا إلى المحلول الهلامي.

بعد ذلك، يُضاف معلق الخلايا إلى جهاز Transwell بقطر 12 مليمتر وحجم مسام 8 ميكرون، ويُحضن عند درجة حرارة 37 °C حتى يتجمد القالب. وتتمثل الخطوة النهائية في إعداد المقايسة في إضافة كميات محددة من الوسط الغذائي إلى أجهزة Transwell لإنشاء ظروف السكون والتدفق. وبعد مرور 24 ساعة، يتم تثبيت أغشية Transwell وصبغها وفحصها بصرياً لتقدير كمية الخلايا الغازية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل غرف التدفق الخلالي الموائعية الدقيقة، في أنها لا تتطلب مضخات أو معدات متخصصة، كما أنها تتيح للباحثين اختبار ظروف أو معالجات متعددة بسهولة وسرعة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة حول الهجرة والغزو الخلوي، إلا أنه يمكن استخدامها أو تطبيقها لدراسة تأثير تدفق السائل الخلالي على سلوكيات خلوية أخرى ذات صلة، مثل التعبير البروتيني، وتكاثر الخلايا، والتغيرات في التأشير الخلوي. وسيكون استعراض هذا الإجراء عبر LIMA two chaa.

يبدأ طالب الدراسات العليا في مختبري هذا الإجراء بوضع كمية صغيرة من الـ matri gel على الثلج عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم تحضير وصفة الهلام باستخدام PBS والماء المعقم، وهيدروكسيد الصوديوم، وmatrigel، وكولاجين ذيل الجرذ من النوع الأول. ثم تُخلط مكونات الهلام على الثلج بنفس التسلسل، ويُحضن المحلول النهائي لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C.

ضع الآن وحدات إدخال استنبات خلايا ذات ثقوب ثمانية بقطر 12 مليمتر في طبق يحتوي على 12 بئراً باستخدام ملقط معقم. ثم قم بعدهاً للخلايا وأعد تعليقها في وسط خالٍ من المصل بتركيز 5 × 10⁶ خلية/ملليلتر، وأضف 100 µL من معلق الخلايا إلى 900 µL من محلول الهلام. بعد ذلك، اخلطهما جيداً عن طريق السحب والدفع اللطيف باستخدام الماصة.

بعد ذلك، أضف 150 µL من الخليط النهائي إلى كل قطعة إدخال (insert). ثم انقل قطع الإدخال إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 °C ونسبة 5% carbon dioxide لمدة 30 دقيقة حتى يتبلمر الهلام. بالنسبة للحالة الساكنة، أضف 100 µL من الوسط الخالي من المصل فوق الهلام و 1,200 µL تحت قطعة الإدخال.

يجب أن تكون مستويات السوائل داخل وخارج الغرسة في البئر متساوية تقريبًا، مما يؤدي إلى وجود حد أدنى من فرق الضغط عبر الهلام وعدم وجود تدفق خلالي. وبالنسبة لحالة التدفق، أضف 100 µL من الوسط الخالي من المصل تحت الغرسة و 650 µL فوق الهلام. وفي الوقت ذاته، حاول تجنب تكوين أي فقاعات هوائية تحت الغرسة لأنها ستمنع الخلايا من الهجرة عبر الغشاء في هذه المواضع.

بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C ونسبة 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة. في هذه الخطوة، أضف 500 µL من PBS بتركيز 1x في كل بئر من طبق 24 بئر جديد لغسل الأدخالات. ثم قم بإزالة الوسط المتبقي في الجزء العلوي من آبار اتجاهات التدفق.

بعد ذلك، استخدم مسحات قطنية لإزالة الهلام من الحشوات. امسح السطح العلوي للغشاء لإزالة الخلايا غير التوعائية (non-VA cells). ثم اغسل الحشوات بوضعها في لوحة ذات 24 بئراً تحتوي على PBS بتركيز 1× لمدة 15 ثانية.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS وأضف 500 µL من para formaldehyde بتركيز 4% أسفل كل قطعة إدراج. تُحضن العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا المهاجرة عبر الغشاء. ثم قم بإزالة PFA وشطفها مرة واحدة باستخدام 500 µL من PBS لإزالة المثبت المتبقي.

بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول 0.5% Triton X 100 أسفل الغرسات واتركها لتحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ولنفاذية الخلايا، قم بقص الأغشية من الغرسة باستخدام شفرة حلاقة. ثم ضعها في 100 µL من محلول DPI بتركيز 2 µg/mL في محلول 1× PBS.

مع الحرص على وضع الجانب السفلي من الغشاء ليكون متجهاً للأسفل. يجب تحضير محلول DPI قبل بضع دقائق من الاستخدام وحفظه في الظلام. الآن، قم بتغليف الطبق بورق الألومنيوم.

ضعها على جهاز هزاز بسرعة 150 RPM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الأغشية بـ 500 microliters من PBS لمرة واحدة، ثم أعدها إلى جهاز الهزاز لمدة 10 دقائق. ولإزالة jy الحر، كرر عملية الغسيل مرتين إضافيتين.

تتمثل الخطوة التالية في وضع الأغشية على شرائح زجاجية بحيث تكون الخلايا المهاجرة موجهة للأعلى. أضف محلول التثبيت إلى الأغشية، ثم غطّها بأغطية الشرائح.

بعد ذلك، قم بعدّ صبغة DPI للنوى واحسب عدد الخلايا الغازية وفقاً للمخطوطة المرفقة. يوضح هذا الشكل خلايا MDA MB 4 35 s المهاجرة عبر الغشاء. تم تثبيت الخلايا الغازية بعد اختبار غزو تدفق السائل الخلالي، وصُبغت بـ DPI و Alexa Fluor 4 88 conjugated foid لتسهيل عد الخلايا الغازية.

هذا هو الغشاء تحت المجهر ذو المجال المضيء، وهنا تظهر النوى المصبوغة بصبغة DAPI. وتظهر هنا خيوط الـ F-actin المصبوغة بـ Alexa Fluor 488. يوضح هذا الرسم البياني أن غزو خلايا الميلانوما النقيلية MDA MB 435 قد تعزز بشكل ملحوظ بواسطة التدفق الخلالي.

بعد مرور 24 ساعة، يتم تطبيع النتائج بالنسبة لمتوسط حالة الغزو الساكن، ويتم عرض المتوسط المستخلص من ستة من أدراج زراعة الخلايا. ويعد الفرق بين الحالات ذا دلالة إحصائية بقيمة P تبلغ 0.003. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إعداد مقايسة تدفق السائل الخلالي في غضون ساعتين، تليها فترة حضانة لمدة 24 ساعة، ثم ساعتان لتثبيت وصبغ أغشية التحويل.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخلاص الخلايا أو البروتينات أو الأحماض النووية بسهولة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تغير التعبير الجيني والبروتيني استجابةً لتدفق السائل الخلالي. ومنذ تطوير هذه الطريقة، أصبحت مقايسة أساسية للباحثين الذين يدرسون تأثيرات التدفق الخلالي على الخلايا السرطانية.