A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص الخلايا الدموية وتصورها وعدّها من اليرقات البرية. يتم تحقيق ذلك أولاً بتخدير اليرقة عن طريق وضعها على الثلج، وحقنها بمحلول منظم يحتوي على مضاد للتخثر، ثم إعادة اليرقة إلى الثلج للسماح للخلايا الدموية بالعودة إلى الدورة الدموية قبل عملية الاستخلاص. وتتمثل الخطوة الثانية في إجراء شق ضحل عند الطرف الخلفي لليرقة باستخدام مشرط نظيف.

بعد ذلك، يتم الضغط بلطف على اليرقة باستخدام ملقط ناعم. ثم يتم سحب مزيج محلول المنظم مع اللمف الدموي باستخدام ماصة دقيقة وجمعه في أنبوب طرد مركزي دقيق. وتتمثل الخطوة النهائية في خلط محلول اللمف الدموي بلطف مع حجم مساوٍ من محلول المنظم، ونقل 10 µL من المحلول إلى مقياس كريات الدم (hemocytometer) لمعاينة وعد الخلايا الدموية.

وفي الختام، يمكن استخدام طريقة استخلاص الخلايا الدموية هذه كطريقة سريعة وفعالة لعد الخلايا الدموية من أنواع مختلفة من اليرقات، والاحتفاظ بها كأداة لفحص الجوانب الفسيولوجية للاستجابة المناعية الخلوية في الحشرات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها لاستخلاص الخلايا الدموية من اليرقات ذات الأرجل الكاذبة الصغيرة جداً. أما نماذج اليرقات الأخرى فيتم سحب دمها عن طريق قطع إحدى الأرجل الكاذبة، ثم استخلاص الخلايا الدموية من السائل المفرز.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لاستخراج الدم اللمفاوي (hemotype) من أنواع أخرى من الحشرات. ويمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أسئلة جوهرية في مجال المناعة البيئية، مثل كيفية تباين الاستجابة المناعية الخلوية للحشرة وفقاً لجودة النظام الغذائي، أو المرحلة التنموية، أو التعرض لمسببات أمراض مختلفة. لبدء هذا الإجراء، قم بتخدير يرقات الطور قبل الأخير عن طريق تبريدها على الثلج لمدة 20 دقيقة قبل استخراج الخلايا الدموية (hemo cyte).

بعد ذلك، قم بتركيب الطرف غير المدبب لإبرة شعرية نظيفة عيار 16 في الأنبوب المتصل بمحقنة زجاجية سعة 20 milliliter. اترك الأنبوب الذي يحتوي على محلول التجميع مفتوحاً على طاولة المختبر. املأ الشعيرة ببطء بحوالي 10 إلى 15 µL من المحلول المنظم.

ثم ضع الإبرة فوق كرة من الصلصال توضع بجانب المجهر التشريحي. ضع اليرقة في طبق بتري، ويجب وضع الحشرة على جانبها بحيث تكون الكريات مرئية بوضوح.

أثناء الفحص باستخدام مجهر تشريحي، ثبّت اليرقة في مكانها باستخدام ملقط، وضع الإبرة بالقرب من إحدى الكريات حيث يكون جلد الحشرة عادةً أكثر ليونة. ثم اضغط بلطف بالإبرة الشعرية على جسم الحشرة. وبمجرد اختراق الإبرة للجلد، احقن الحجم الكلي من المحلول داخل اليرقة.

سوف ينتفخ جسم اليرقة بعد الحقن، ولكن يجب ألا ينفجر أو يسرب السوائل. أعد اليرقة إلى طبق بتري المبرد. ضع الحشرة في وضعية ظهرية لمنع تسرب المحلول المنظم من الجرح.

كرر عمليات الحقن لكل يرقات يتم استخلاص اللمف الدموي منها. بعد ذلك، اترك جميع الحشرات لتبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة. الآن، ضع اليرقة في أطباق بتري تحت المجهر التشريحي.

قم بإجراء شق سطحي بعناية بطول يتراوح بين مليمترين إلى ثلاثة مليمترات في المنطقة الخلفية لليرقة، باستخدام مشرط معقم دون إتلاف الأمعاء أو الأعضاء الداخلية الأخرى. بعد ذلك، اضغط على اليرقة برفق باستخدام ملقط بلاستيكي مرن مع جمع ما يقارب 10 إلى 20 µL من خليط الهيموليمف باستخدام طرف ماصة سعة 10 µL. ومرة أخرى، توخَّ الحذر لتجنب إصابة الأنسجة الداخلية.

بعد ذلك، تخلص من بقايا اليرقات. اجمع اللمف الدموي من كل يرقة في أنابيب طرد مركزي دقيقة من السيليكون سعة 0.5 milliliter منفصلة ومصنفة. ثم أضف ما يقرب من 10 إلى 20 µL من محلول الحضن إلى كل عينة لمف دموي تم جمعها من يرقة واحدة.

حافظ على عينات الدم اللمفاوي مبردة على الثلج في جميع الأوقات خلال هذه الخطوة. امزج عينة الدم اللمفاوي ومحلول الحضن مباشرة قبل عدّ الخلايا الدموية (hemocytes).

تسمح هذه المعالجة بفصل الخلايا الدموية بشكل صحيح وتمنع تكتلها. استخدم رأس ماصة نظيف لنقل 10 µL من عينة الدم اللمفاوي المخلوطة بمحلول الحضن إلى مقياس كريات الدم. ثم باستخدام مجهر مركب، قم بعدّ وتسجيل عدد الخلايا الدموية في 15 مربعاً على الأقل من المربعات الكبيرة في الشبكة المركزية لمقياس كريات الدم.

أضف هذه القيم للحصول على المجموع الكلي لعدد الخلايا الدموية في المربعات الـ 15. بعد ذلك، اشطف مقياس كرات الدم والشريحة الغطائية الخاصة به جيداً باستخدام زجاجة غسيل تحتوي على ماء مقطر ومزال الأيونات. ثم جففهما باستخدام مناديل Kim wipes.

كرر هذه الإجراءات لبقية عينات السائل الدموي، واحسب متوسط عدد الخلايا الدموية لكل مليلتر من حجم السائل الدموي لكل يرقة. تُظهر صورة المجهر الضوئي الخلايا الدموية المستخلصة من يرقات nucle hin ai بتكبير 20x. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام الخلايا الدموية التي تم جمعها لدراسة الاستجابة المناعية الخلوية وإعداد اختبارات مثل البلعمة والـ cap، والتغليف الانتقائي، ونشاط pH oxidase.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن جمع الـ R-N-A-D-N-A والبروتين غير المستخدم لإجراء فحوصات إضافية من أجل دراسة هذه الاستجابة المناعية الخلوية في الحشرات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن اليرقات بغرض استخلاص اللمف الدموي وكيفية جمع اللمف الدموي الذي يحتوي على خلايا دموية حية.